论文总字数：19138字

摘 要

腺苷激酶（AK，EC 2.7.1.20）是合成腺苷酸的关键酶，能催化腺苷下生成AMP，进而磷酸化生成ATP等重要产品，在临床畜禽业中有着广泛的应用。本文以酿酒酵母和结核杆菌为出发菌株，克隆了编码腺苷激酶的基因ak，在体外与大肠杆菌pET28a质粒重组，随后导入E.coli BL21中进行过表达，SDS-PAGE检测目的蛋白，进而催化腺苷生成AMP和ADP，通过HPLC检测底物腺苷反应量，研究重组菌腺苷激酶的表达能力。

通过聚合酶链式反应得到带有XhoI/EcoRI末端序列的酿酒酵母和结核杆菌腺苷激酶（ak）基因，并通过胶回收使其纯化，然后利用ClonExpress^TM快速克隆技术将纯化后目的基因在体外与大肠杆菌pET28a质粒重组，随后导入E.coli DH5α中进行质粒的扩增，再导入E.coli BL21中得到重组菌株E.coli BL21(pet28a-adok-S)和E.coli BL21(pet28a-adok-MT) 并以此作为腺苷激酶的表达菌株。对重组菌表达的腺苷激酶进行酶活测定显示：重组菌E.coli BL21(pet28a-adok-S)酶活为54.336U/g湿菌体，是原始菌株酶活的8.5倍；重组菌E.coli BL21(pet28a-adok-MT)酶活为12.435U/g湿菌体，是原始菌株酶活的2倍，也表明来源于酿酒酵母的ak基因比来源于结核杆菌的ak基因表达效果更好。

关键词：腺苷激酶 过表达 酶活测定

Construction of adenosine kinase overexpressing strains and determination of enzyme activity

Abstract

Adenosine kinase (AK EC 2.7.1.20) which catalyzes AMP from adenosine is a key enzyme for the synthesis of adenylate. As this enzyme involved in production of ATP and other important products used in medical and poultry industry, it has a wide range of applications. In this paper, Saccharomyces cerevisiae and Mycobacterium tuberculosis were used as clones to clone the gene ak of adenosine kinase which was recombined in vitro with Escherichia coli pET28a plasmid and then introduced into E. coli BL21. SDS-PAGE was used to detect the target proteins and Adenosine was catalyzed to produce AMP and ADP. The substrate (adenosine) was detectd by HPLC for studyding the activities of recombinant adenosine kinase.

The Saccharomyces cerevisiae and Mycobacterium tuberculosis adenosine kinase (ak) gene with XhoI / EcoRI terminal sequence were obtained by polymerase chain reaction and purified by gel recovery. The designed fragment was inserted to the plasmid by ClonExpressTM rapid cloning technique. The recombinant plasmids were then transformed into E. coli BL21. The results showed that activity of adenosine kinase expressed by recombinant bacteria showed that the enzyme activity of E. coli BL21 (pet28a-adok-S) was 54.336U/g wet bacteria which was 8.5 times of that of the original strain. The enzyme activity of recombinant strain E.coli BL21(pet28a-adok-S) is 12.435U/g，which is twice as much as that of the original strain. The results indicated that the ak gene derived from Saccharomyces cerevisiae is more effective than that from Mycobacterium tuberculosis.

Key Words：adenosine kinase；overexpression；enzyme activity determination

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 腺苷激酶 1

1.1.1 腺苷激酶简介 1

1.1.2腺苷激酶应用 1

1.1.3基于腺苷激酶的产品 1

1.2 过表达菌株的构建及酶活测定 3

1.2.1 腺苷激酶的克隆 3

1.2.2 过表达菌株的选择 4

1.2.3 腺苷激酶酶活测定 4

1.3 立题背景与研究内容 5

1.3.1 立题背景 5

1.3.2 研究内容 5

第二章 腺苷激酶表达载体的构建 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 菌株与质粒 6

2.2.2 培养基及培养方法 7

2.2.3工具酶和试剂盒 8

2.2.4实验仪器 8

2.2.5 实验试剂 9

2.3 实验方法 9

2.3.1 ak基因的扩增 9

2.3.2 ak基因的纯化 10

2.3.3 腺苷激酶表达载体的构建 11

2.4 结果与讨论 13

2.4.1 酿酒酵母和结核杆菌ak基因的PCR扩增 13

2.4.2 表达载体的构建 13

2.5 本章小结 14

第三章 腺苷激酶的表达鉴定及酶活测定 15

3.1 前言 15

3.2 实验材料 15

3.2.1工具酶和试剂盒 15

3.2.2实验仪器 15

3.2.3 实验试剂 16

3.3 实验方法 17

3.3.1 重组腺苷激酶的表达与鉴定 17

3.3.2 重组腺苷激酶的酶活测定 19

3.4 结果与讨论 20

3.4.1 重组腺苷激酶的鉴定 20

3.4.2 重组腺苷激酶的酶活测定 21

3.5 本章小结 21

第四章 结论与展望 23

4.1 结论 23

4.2 展望 23

参考文献 24

第一章 文献综述

1.1 腺苷激酶

1.1.1 腺苷激酶简介

腺苷激酶(adenosinekinase ,AK)在生物体内参与核酸代谢过程,起着调节腺苷浓度的作用,在肝脏、肾脏等中都发挥着重要的生理效应。AK有5种常见同工酶：Ake、Aky、AK1、AK2、AK3。其中，Ake来源于大肠杆菌，Aky来源于酵母，后三者都来源于脊椎动物 ^[1] 。AK1、AK2、AK3分别存在于细胞质胞浆、线粒体内外膜之间、线粒体基质中，即把在细胞中所处位置作为脊椎动物中的三种同工酶的区分依据。以上的5种腺苷激酶在Mg² 作为辅因子存在下，都能催化腺苷生成AMP，进而磷酸化生成ATP、cAMP等，生理层面上对机体内能量供应的稳定起着重要作用。

1.1.2腺苷激酶应用

腺苷激酶是合成腺苷酸的关键酶^[2]，能催化腺苷下生成AMP，进而磷酸化生成ATP、cAMP等重要产品。MB Cassera等科学家通过基因组分析显示冈比亚疟蚊（AgAK;非洲传播的恶性疟原虫的最重要的载体）的腺苷激酶的蚊子直向同源物。腺苷的特异性和紧密结合来Asn14，Leu16，Leu40，Leu133，Leu168，Phe168和Thr171的氢键相互作用以及Ile39和Phe168的主链与腺嘌呤环以及通过Asp18，Gly64和Asn68和核糖基2'-和3'-羟基。该结构与人腺苷激酶的结构（48％相同）比来自弓形虫的AK的结构（31％相同）更相似。由于对AgAK具有这种非凡的亲和力，腺苷被有效地捕获并在扩散极限附近转化为AMP，这表明该酶在维持腺嘌呤核苷酸池方面具有重要作用^[3]。此外，腺苷激酶在医学方面比如在创伤性脑损伤中对神经元凋亡^[4] ，以及通过调节腺苷水平的关键环节,从而进行抗癫痫和神经保护^[5]等方面具有重要作用。

1.1.3基于腺苷激酶的产品

在腺苷激酶的催化作用下，腺苷首先生成AMP，然后经过一系列磷酸化生成ADP和ATP，在腺苷酸环化酶（AC）的催化下，三磷酸腺苷生成相应的衍生物环腺苷酸^[6]（cAMP），ATP和cAMP都是具有极大药用价值的生物化学产品。

图1-1 腺苷激酶催化及衍生物生成路径

请支付后下载全文，论文总字数：19138字