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摘 要

腺苷激酶（adenosine kinase，ak）为核苷激酶的一种，可催化腺苷生成5′—腺苷酸（AMP），可在其它核苷激酶共同作用下合成5'-三磷酸腺苷（ATP）等高附加值的产品。本实验室已通过基因工程的手段获得一株高产酿酒酵母腺苷激酶的重组大肠杆菌E.coli BL21(pet28a-adok-S)。为了提高腺苷激酶的催化效果，本文试图探究该菌株的全细胞催化性能，并对其催化条件（温度、pH、表面活性剂，金属离子激活剂等）进行了优化。研究表明该菌株在温度50-55℃，pH在6-7范围内，镁离子加入量30mM左右,用0.03% TritonX-100处理后的重组大肠杆菌表现出较好的催化效果。这为该重组大肠杆菌的工业化应用提供了一定的理论基础。

关键词：腺苷激酶，重组大肠杆菌，全细胞催化，条件优化

ABSTRACT

Adenosine kinase (adenosine kinase, ak) is a kind of nucleoside kinase, which can catalyze the formation of 5'-adenylate (AMP) by adenosine, which can synthesize 5'-tripHospHate adenosine under the action of other nucleoside kinases ATP) and other high value-added products. A recombinant E.coli BL21(pet28a-adok-S), a highly productive Saccharomyces cerevisiae adenosine kinase, was obtained by means of genetic engineering. In order to improve the catalytic effect of adenosine kinase, this paper attempts to explore the whole cell catalytic performance of the strain, and its catalytic conditions (temperature, pH, surfactant, metal ion activator, etc.) were optimized. The results showed that the strain had a good catalytic effect at the temperature of 50-55 ℃, pH in the range of 6-7, the addition of magnesium ion was about 30mM, and the recombinant E. coli was treated with 0.03% TritonX-100. This provides a theoretical basis for the industrial application of recombinant E. coli.

KEYWORDS：Adenosine kinase；Recombinant E. coli；Whole cell catalysis；Optimization

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1腺苷 1

1.1.1腺苷简介 1

1.1.2腺苷的生理功能 1

1.2腺苷激酶 2

1.2.1腺苷激酶简介 2

1.2.2腺苷激酶的催化机制和生物学功能 2

1.2.3基于腺苷和腺苷激酶的产品及应用 3

1.3全细胞催化 4

1.3.1全细胞催化原理 4

1.3.2全细胞催化的优势 4

1.3.3全细胞催化研究方法 5

1.4本课题的立题背景和研究内容 7

1.4.1 立题背景 7

1.4.2 研究内容 7

第二章 材料与方法 8

2.1.实验材料 8

2.1.1实验菌株 8

2.1.2实验培养基 8

2.1.3实验试剂 8

2.1.4实验仪器 8

2.2实验和分析方法 9

2.2.1大肠杆菌菌种活化 9

2.2.2种子培养 9

2.2.3酶活性测定 10

2.2.4底物腺苷的测定 10

第三章 重组大肠杆菌腺苷激酶全细胞催化条件优化 12

3.1实验方法 12

3.1.1不同初始pH的影响 12

3.1.2不同金属离子的影响 12

3.1.3不同浓度的Mg² 的影响 13

3.1.4不同浓度的TritonX-100的影响 14

3.1.5不同反应温度的影响 14

3.1.6转化反应的时间的影响 14

3.2实验结果与分析 15

3.2.1不同初始pH的影响 15

3.2.2不同金属离子的影响 16

3.2.3不同浓度的Mg² 对的影响 17

3.2.4不同浓度的TritonX-100的影响 17

3.2.5不同温度的影响 18

3.2.6转化反应时间的影响 19

3.3本章小结 20

第四章 结论与展望 21

4.1 结论 21

4.2 展望 21

参考文献 22

文献综述

1.1腺苷

1.1.1腺苷简介

腺苷（Adenosine，简称Ado）是一种遍及生物体细胞的嘌呤核苷，化学名为9-β-D-呋喃核糖基，化学式为C₁₀H₁₃N₅O₄，结构式如图1-1：

图1-1腺苷结构式

由常见的腺嘌呤碱基上与D-核糖组成，二者之间通过一个β-N-糖苷键连接而成，在观察结构式可以看出腺苷的戊糖羟基发生磷酸化反应而形成磷酸酯成为腺苷酸，继而合成三磷酸腺苷（ATP），并成为其核心结构^[1]。

1.1.2腺苷的生理功能

腺苷可以调节生物体心血管组织系统、神经组织系统^[2]和免疫系统^[3]。腺苷普遍分布生物体内，是一种存在于生物细胞的活动调控物质，腺苷可以在生物体内部环境发生恶变时，应急情况下细胞产生大量的腺苷。期间腺苷作为一种可以转化成能量的底物通过调控细胞乃至调控局部组织的能量代谢转换促进内皮祖细胞独特的促血管生成能力^[3]，维持机体内平衡，抵挡细胞来自高浓度糖带来的伤害，实现血管的早期快速内皮化，帮助血管的重新生成的目的^[4]。 腺苷还可以通过改善生物体血管组织环境结构，增加组织工程血管的通畅率^[5]，维持血液供给^[6]。腺苷还可以充当一种神经递质，能够作用于各个脑部系统，保持中枢神经系统的正常状态^[7]，具有抗癫痫、神经保护作用^[8]和诱发生理性睡眠解决失眠问题等^[9]。

1.2腺苷激酶

1.2.1腺苷激酶简介

腺苷激酶(adenosine Kinase，简称AK)是一种单体磷酸转移酶，将底腺苷与游离的磷酸结合，属于核糖激酶家族，1943年由 Colowick和Kalckar在生物肌肉组织中发现，以此命名为肌激酶^[10]。作为一种嘌呤的合成补救途径，继而研究发现在哺乳各类器官组织细胞中腺苷均大量存在，而根据其发挥着在生物体内对腺苷浓度的调控^[11]，命名为腺苷激酶，酶编号为EC 2.7.1.20。

1.2.2腺苷激酶的催化机制和生物学功能

腺苷激酶是一种核苷激酶，是调控腺苷浓度的最根本途径，能够催化腺苷生成磷酸腺苷。具体调节机制过程是底物腺苷(Ado)通过腺苷激酶磷酸化合成5’—一磷酸腺苷(Adenosine monophosphte，AMP），在同个反应体系中与腺苷酸激酶（Adenylate kinase）、乙酸激酶（Acetatekinase）相偶联合成三磷酸腺苷^[12]。比起合成偶联酶法另一条途径：以5’—一磷酸腺苷为底物利用腺苷酸激酶催化为二磷酸腺苷（adenosine diphosphate；简称ADP），最后使用乙酸激酶实现以腺苷为起始底物合成三磷酸腺苷^[13]，底物更加易获取，合成过程更加简便，整个反应的详细过程如下图1-2所示。

在生物机体内，可以利用这个途径与糖酵解途径共同作用，最终以能量代谢的方式，控制机体各项活动，腺苷激酶尽管就参与了少数的反应，但却是关键的一步，进而对组织细胞中腺苷和腺苷酸（包括ATP、 ADP、 AMP）的浓度^[14],进行调节，导致体内腺苷水平降低。

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