论文总字数：27669字

摘 要

将UDP-糖基转移酶（UGT76G1）基因和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因，应用同源重组技术，在酿酒酵母YPH499基因组上进行整合表达，得到重组细胞YPH499K，赋予其同时表达糖基转移酶和葡萄糖焦磷酸化酶的能力。发酵培养重组细胞，运用全细胞催化，以重组的酿酒酵母YPH499K为催化剂，利用简单廉价的糖源，过表达UGPase增加UDPG糖基供体量，并在糖基转移酶UGT76G1的作用下，以甜菊苷为底物合成莱鲍迪苷A。结果表明，UGPase和UGT76G1基因成功整合至酿酒酵母的基因组上，且正确表达的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶和UDP-糖基转移酶具有生物学活性。催化反应36 h后，莱鲍迪苷A的得率达到99.2 %。

关键字：UDP-糖基转移酶 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 酿酒酵母 同源重组 莱鲍迪苷A

Construction and Application of Integrated Expression of UDP-Glycosyltransferase and UDP-Glucose Pyrophosphorylase Recombinant Saccharomyces cerevisiae

ABSTRACT

Through the method of homologous recombination,UDP-glycosyltransferase (UGT76G1) gene and UDP-glucose pyrophosphorylase gene were integrared into the genome of Saccharomyces cerevisiae YPH499,giving its ability to express both glycosyltransferase and glucose pyrophosphorylase simultaneously,and then named it YPH499K.Adopting whole cell catalysis, fermenting culture recombinant cells,with a simple and inexpensive source of sugar, recombinant Yeast YPH499K as a catalyst, we overexpress of UGPase increased UDPG glycosyl donor volume. Then,in the role of glycosyltransferase UGT76G1, stevioside is as a substrate for the synthesis of levodi glycoside A.The results showed that UGPase and UGT76G1 genes were successfully integrated into the genome of Saccharomyces cerevisiae, and the correctly expressed UDP-glucose pyrophosphorylase and UDP-glycosyltransferase were biologically active. After 36 h of catalytic reaction, the yield of rebaudioside A reached 99.2%.

Key Words: UDP-glycosyltransferase; UDP-glucose pyrophosphorylase; Saccharomyces cerevisiae; Homologous recombination; Rebaudioside A

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 I

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2 UDP-糖基转移酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的简介及应用 2

1.2.1 UDP-糖基转移酶 2

1.2.2 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶 2

1.3酿酒酵母表达系统 3

1.3.1 酵母系统简介 3

1.3.2 酿酒酵母基因表达系统的优点 3

1.4 整合表达UDP-糖基转移酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶重组酿酒酵母的构建方法 3

1.4.1同源重组法 3

1.4.2同源重组的应用 4

1.5 RA苷的合成方法 4

1.5.1 直接提取法 4

1.5.2 酶促修饰法 5

1.5.3. 全细胞催化法 5

1.5.4 发酵法 5

1.6 高效液相色谱检测RA苷法（HPLC） 5

1.7本课题的应用及研究意义 6

第二章 重组酿酒酵母整合表达UDP-糖基转移酶和UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的构建及应用 7

2.1前言 7

2.2实验材料 7

2.2.1.实验仪器 7

2.2.2实验试剂及培养基 8

2.2.3菌株与质粒 8

2.2.4工具酶、Marker与试剂盒 9

2.3实验方法 9

2.3.1 同源臂引物的设计 9

2.3.2目的基因片段的获取 10

2.3.3 重组酿酒酵母YPH499K的构建 11

2.3.4 重组酿酒酵母YPH499K的性质研究 13

2.3.5 重组菌催化甜菊糖苷生成莱鲍迪苷A的研究 14

第三章 实验结果与讨论 16

3.1 PCR同源臂引物结果 16

3.2单酶切验证PCR片段结果 17

3.3 菌落PCR阳性克隆结果 18

3.4重组菌生长情况与葡萄糖消耗量测定结果 18

3.5 重组酿酒酵母催化反应结果分析 19

3.5.1莱鲍迪苷A标准曲线 19

3.5.2 标准品高效液相色谱检测鉴定 20

3.5.3 双酶催化产物分析 21

3.5.4甜菊糖苷催化生成莱鲍迪苷A苷的产量 22

3.5.5催化反应中重组菌生长情况与葡萄糖消耗量测定结果 23

第四章 结论与展望 24

4.1实验结论 24

4.2实验展望 24

参考文献 26

致 谢 30

第一章 文献综述

1.1前言

莱鲍迪苷A（Rebaudioside A，RA 苷）是一种天然甜味剂，来源于甜叶菊，是甜菊糖的主要成分之一。其基本骨架是四环二萜醇苷，它在C-13位上的糖苷键上连有三个葡萄糖基，在C-19位上的酯键上连有一个葡糖糖基^[1]。高纯度RA苷为固体粉末，色白味甘，能溶于水、乙醇等常见溶剂。莱鲍迪苷A耐高温且耐酸碱，但在pH 2.0-8.0的水溶液中，会有部分水解^[2]。RA苷在相对湿度60%的条件下，可以常温稳定保存两年，若是在避光的条件下，稳定性会更好^[3]。

莱鲍迪苷A是一种健康安全且优质的食品添加剂，在2008被美国食品和药物管理局认可为安全添加剂。RA苷相比于甜菊苷（Stevioside, St苷），甜味纯正、无不良口感，是一种最为理想的蔗糖替代品^[4]。然而现在，一般市面上出售的甜菊糖中St 苷为主要成分，由于St 苷味苦，降低了甜菊糖的口感^[5]。因此，增加RA 苷在甜菊糖总苷中的所占比例，将会有效改善甜菊糖味质^[4]。近年来，已有许多策略可成功将RA苷从甜菊糖中分离，譬如，高速逆流色谱法，制备液相色谱法以及吸附分离法^[6,7,8,9]等。均可用来制备高纯度的RA苷产品。

请支付后下载全文，论文总字数：27669字