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摘 要

CRISPR/Cas9系统是基因组修饰的重要工具，与常用的类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)和锌指核酸内切酶(ZFN)技术一样，可进行复杂的基因组编辑，本论文以单链供体寡核苷酸（ssODN）为模板,进行哺乳动物的表达基因后，使用与CRISPR/Cas9系统对基因组进行修饰，定点敲入HindIII酶切位点，获得成功KI的效率评估及单克隆鉴定。

关键词： CRISPR/Cas9 ssODN 基因编辑

Use the CRISPR/Cas9 fixed-point type HindIII site of enzyme method

Abstract

CRISPR / Cas is a technique in which the source is a bacterial-acquired immunization by RNA to target the modification of the target gene. The CRISPR / Cas9 system can be used for editing a variety of complex genomes as with zinc finger endonucleases (ZFN) and the transcriptional activator effector nuclease (TALEN). In this paper,we using the single stranded donor oligonucleotide (ssODN) as a template, the marker gene was injected into the HindIII enzyme loci and the CRISPR / Cas9 system was genetically modified in the mammalian expression gene, and the efficiency of the successful KI was evaluated and monoclonalwe .

Key words: CRISPR / Cas9； ssODN；Gene editing；

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 CRISPR/Cas9系统简介 1

1.2 CRISPR/Cas9基因组编辑 1

1.3 CRISPR/Cas9系统特点 1

1.4 CRISPR/Cas9技术应用 5

1.5 设计内容CRISPR/Cas9 6

1.6 本课题的研究目的及意义 7

第二章 CRISPR/Cas9技术 8

2.1 实验试剂与仪器 8

2.1.1 实验主要试剂 8

2.1.2 实验仪器 8

2.2 设计方案 9

2.2.1 设计流程图 9

2.3 gRNA设计 9

2.3.1 设计方法 9

2.3.2 gRNA设计原则 10

2.4 构建重组质粒 11

2.5 设计ssODN修复模板 12

2.5.1 同源重组方式 12

2.5.2 ssODN模板序列 13

2.6 实验方法 12

2.6.1 细胞复苏 12

2.6.2 细胞的传代与培养 12

2.6.3 细胞转染 12

2.6.4 嘌呤霉素与单细胞生长 13

2.6.5 Cell pool与单克隆筛选 13

2.7 实验结果 12

2.6.1 单克隆PCR产物 12

2.6.2 HindIII酶切 12

2.6.3 测序结果 12

2.7 本章小结 12

第三章 结论与展望 17

3.1 结论 17

3.2 展望……………..………………………………..…………………………17

参考文献 18

致 谢 20

第一章 文献综述

1.1 CRISPR/Cas9系统简介

日本课题组在1987年发现K12E.coli的碱性磷酸酶基因附近存在串联间隔重复序列[1]，这种成簇的、规律间隔的短回文重复序列，称为CRISPR系统。CRISPR主要由Cas1，Cas2等Cas基因，前导序列（Leader sequence），正向重复序列共同组成，如图1所示。由于Cas蛋白是具有核酸相关的功能域的编码蛋白，因此能对入侵的DNA通过位点的特异性进行切割。前导序列作为启动子，启动CRISPR序列的转录，crRNA则是转录产生的非编码RNA。Cas蛋白与crRNA共同参与完成CRISPR的免疫防御过程。随后的研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，2002年科学家将其正式命名为Clustered regularly interspaced short palindromic repeats （CRISPR），无论是在简单还是复杂的基因组编辑中，(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9 系统成功被改造为第三代人工核酸内切酶。CRISPR与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可应用于基因编辑。相比而言，CRISPR/Cas9基因组编辑技术的应用前景更为广泛，因其不仅能够实现基因的定点敲入和敲除，进行复杂的小片段基因缺失和两位点同时突变等。还能够节约成本，提高突变效率，操作更为准确、简单。CRISPR/Cas9对基因分子进行改造的效果显著，是基因分子改造的有利工具。现在这门技术已经成功精确修饰了人类细胞，斑马鱼和小鼠及细菌的基因组。

1.2 CRISPR/Cas系统基因组编辑

CRISPR/Cas是目前使用的基因编辑三大技术之一，基因编辑首先在特异性位点发生双链断裂，修复方式之一是基因组与供体基因发生同源重组(HR)，并引入外源DNA片段，从而实现基因的敲入和敲除；另一修复方式是非同源末端连接机制（NHEJ），通过染色体末端重新连接进行的修复。但非同源末端连接机制容易发生基因组插入或基因组缺失后的移码错误。CRSIPR/Cas与锌指核酸酶(zinc-fi nger nuclease，ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nuclease,TALEN ）在基因组编辑中均为特异性序列的核酸酶。由于Cas蛋白结构和基因序列各不相同，所以特异性的非编码RNA由CRISPR相关的Cas基因和核酸酶活性所决定。因此可将CRISPR/Cas系统分为三种类型，I型、II型和III型。

I、III型CRISPR/Cas系统在基因编辑中较为复杂，需要多个Cas蛋白形成复合物才能实现靶DNA链的有效切割。II型CRISPR/Cas系统相对而言较为便捷、简单，因为II型CRISPR/Cas系统在发挥功能时只需要一个Cas蛋白即可对DNA链进行切割，因此II型也是目前被成功改造的人工核酸酶。

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