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摘 要

解脂耶氏酵母是用于在生物产品中生产含油细胞的平台，并且是研究最广泛的非常规酵母之一。本文简单介绍了解脂耶氏酵母的研究意义、其产油基因组成，并介绍了一种较为成熟的位点特异的基因重组技术—Ura-blaster基因重组技术，包括URA3基因、HisG -URA3-HisG删除组件等重要元素。本篇论文是基于现有的解脂耶氏酵母代谢的实验室研究，结合针对解脂耶氏酵母产油代谢途径优化的代谢工程和合成生物学方面的成果，研究解脂耶氏酵母产油途径中关键基因Lro1对产油途径的具体影响。本实验是基于Ura - blaster代谢敲除法，构建包含同源臂和被选择性标记的URA3基因的基因敲除盒即P-HisG -URA3-HisG - T序列（P：promoter,是Lro1基因自身的启动子；URA3：筛选标记；T：terminator,是Lro1基因自身的终止子），引入解脂耶氏酵母，通过同源重组敲除目的基因,获得突变菌株并对其进行培养，来研究Lro1对解脂耶氏酵母产油的影响。

关键词：URA-Blaster基因重组技术 解脂耶式酵母产油关键基因Lro1 同源重组

Study on knocking out Lro1, a key gene for oil production from Yarrowia lipolytica based on Ura-blaster gene recombination technology

Abstract

Yarrowia lipolytica is a platform for producing oleaginous cells in biological products and is one of the most widely studied unconventional yeasts. This article briefly introduced the research significance of Yarrowia lipolytica and its gene composition of oil production, and introduced a more mature site-specific gene recombination technology-Ura-blaster gene recombination technology, including URA3 gene, HisG-URA3-HisG delete important elements such as components. This paper is based on the existing laboratory research on the metabolism of Y. lipolytica, combined with the results of metabolic engineering and synthetic biology optimized for Y. lipolytica oil production metabolic pathways, to study Y. lipolytica production The specific effect of Lro1, a key gene in the pathway, on the oil production pathway. This experiment is based on the Ura-Blaster metabolic knockout method to construct a knockout box containing homologous arms and a selectively labeled URA3 gene, P-HisG-URA3-HisG-T sequence (P:promoter, which is the Lro1 gene itself Promoter; URA3: screening marker; T: terminator, the terminator of the Lro1 gene itself), introduction of Y. lipolytica, knock-out of the gene of interest by homologous recombination, acquisition of mutant strains and cultivation thereof, to study Lro1 pairs The effect of Y. lipolytica on oil production.

Key words: Ura-blaster gene recombination technology;key gene for oil production of Yarrowia lipolytica; homologous recombination

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.1.1解脂耶氏酵母的背景 1

1.1.2解脂耶氏酵母产油机制 2

1.2基因敲除 3

1.2.1基因敲除的原理 3

1.2.2基因敲除的方法 4

第二章 实验材料与方法 6

2.1实验材料与仪器 6

2.1.1 菌种 6

2.1.2 材料与仪器 6

2.1.3 培养基 8

2.2实验方法 9

2.2.1制作大肠杆菌感受态（转化） 9

2.2.2质粒提取方法 9

2.2.3酶切 10

2.2.4 DNA凝胶电泳回收 11

2.2.5快速提取DNA 12

2.2.6基因删除组件的构建 12

第三章 实验结果与分析 13

3.1解脂耶式酵母产油关键基因Lro1的敲除思路 13

3.2 Lro1敲除菌的构建 14

3.2.1 Lro1敲除组件盒——PLT盒子的构建 14

3.2.2利用同源重组敲除Lro1基因 16

第四章 结论与展望 18

4.1结论 18

4.2 展望 18

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1研究背景

1.1.1解脂耶氏酵母的背景

微生物脂质生产已经在合成特种化学品和从低成本碳原料生产燃料和大宗化学品方面获得应用。考虑到对脂质分子的高需求，农业残留物和木质纤维素材料的微生物转化已经成为近期研究的主题。近来脂肪酸（FA）作为能量丰富分子的可持续生产的一种简单脂引起了许多关注。脂肪酸可以从植物和微生物资源获得。微生物脂质具有多种优势，包括生产速度快，生产更多，季节和气候条件更灵活，并且易于扩展。微生物平台可以生产木质纤维素糖或低价值疏水性底物如废油生物燃料，功能性脂质和其他增值生物制品^{[1,2 ]}。由于植物油价格的上涨、新型发酵技术的引入以及多功能工程菌的使用，使得传统工业微生物菌株的地位变得更加敏感。

在能够产生大于其干细胞重量的20％的水平的天然产油生物中，良好表征的酵母-解脂耶氏酵母引起了人们的特别关注^[3]。这种酵母能够积累大量的脂质（在某些情况下，其含量超过其干重的50％），包括不同发酵配置的几种技术已经应用于在各种农业生产中生长的解脂耶氏酵母菌株的单细胞油生产中，这些方法的潜在应用是针对具有特定结构或组成的储备脂类的生产，其中包括（i）富含必需不饱和脂肪酸的油作为潜在的营养补充物，（ii）显示组成与可可脂的具有相似性的油脂，（iii）用于合成生物燃料的可再生原料的非特异性油。因此，越来越多的研究兴趣集中在基因和代谢工程方法上，以“构建”酵母菌株作为细胞工厂的基本手段来储存和生产具有吸引力的脂肪酸组合物。

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