论文总字数：23043字

摘 要

本文研究了番茄植物根际促生菌，采用固氮培养基从番茄根际土壤中筛选选出的26株促生菌，选出其中的三株优势菌株N14、F17、F9，并对这三株菌的菌落种类、形态，以及溶磷能力及产生IAA的能力进行了研究。通过革兰氏染色，芽孢染色对菌体的形态特征进行了观察，并采用16RsDNA对三株菌进行鉴定后，得出三株菌都为巨大芽孢杆菌，都有芽孢，且都为革兰氏阳性菌。通过磷钼蓝比色法测得三株菌均有溶磷能力，其中F17较弱仅为4.69mg/L,另外两株菌N14和F9的溶磷能力较强，溶磷量能达15mg/L，可以考虑投入到番茄生产中。也通过IAA测定法得出三株菌都能产生IAA，说明三株菌都具有促生能力，其中F17和F9产量达到125.3~249.8mg/L，说明这两株菌的促生能力十分强，N14比较弱，仅为14.9mg/L。

关键词：根际促生菌 IAA 溶磷

Screening and identification of tomato rhizosphere growth-promoting bacteria

Abstract

In this paper, the rhizosphere growth-promoting bacteria of tomato plants were studied. Twenty-six probiotics were selected from the soil of tomato rhizosphere by nitrogen-fixing medium and three dominant strains N14, F17, and F9 were selected and the three strains were selected. The species, morphology, and ability of phosphorus dissolving and the ability to produce IAA were studied. The morphological characteristics of the bacteria were observed by gram staining and spore staining. After the identification of the three strains of bacteria using 16Rs DNA, it was concluded that all the three strains were Bacillus megaterium, spores, and Grams. Positive bacteria. All of the three bacteria had the ability of phosphorus solubilization by the phosphomolybdic blue colorimetric method, of which F17 was only weaker than 4.69 mg/L. The other two bacteria N14 and F9 had strong phosphorus-solubilizing ability, and the dissolved phosphorus could reach 15mg/L. L, consider investing in tomato production. The IAA assay also showed that all three strains could produce IAA, indicating that all three strains had the ability to promote growth, and the yields of F17 and F9 reached 137.90-275.05 mg/L, indicating that the two strains had very strong growth-promoting ability. N14 is relatively weak, only 12mg/L.

Key words: Rhizobacteria; IAA; phosphorus dissolution

目 录

摘 要

Abstract

第一章 引言

1.1促生菌的概念

1.2促生菌的分类

1.2.1根际固氮菌

1.2.2根际解磷菌

1.2.3根际解钾细菌

1.3根际菌的作用机制

1.4植物根际促生菌的应用

1.4.1减少应力乙烯

1.4.2改变植物激素的含量

1.4.3改善必需矿物元素的吸收

1.5植物根际促生菌的研究现状

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1土样

2.1.2筛选培养基

2.1.2分离纯化培养基

2.1.3发酵培养基

2.1.4比色液

2.1.5微量元素溶液(1L)

2.1.6实验仪器

2.2实验方法

2.2.1促生菌的筛选及纯化

2.2.2促生菌的鉴定

2.2.3促生菌株 DNA 水平鉴定

2.2.4分泌植物生长素测定

2.2.5溶磷性测试

第三章 结果与讨论

3.1促生菌株的形态特征

3.1.1促生菌株在油镜下的形态

3.1.2促生菌株在BMS培养基平板上的形态

3.1.3促生菌的革兰氏染色

3.1.4促生菌的芽孢染色

3.1.5促生菌的形态总结

3.2促生菌株的16SrDNA序列分析

3.3促生菌株分泌吲哚乙酸的能力

3.4促生菌株的溶磷能力

第四章 结语与展望

4.1结语

4.2展望

参考文献

致 谢

第一章 引言

1.1促生菌的概念

土壤是一个小的生态系统，里面生活着大量的动物以及微生物。根际是存在于土壤中一块特殊的微小区域。这块区域是以植物的根系为中心，半径几毫米的微小区域。在这个微小的区域里生活着很多的微生物，其中就包含了根际促生菌。 促生菌是一类对植物生长发育有积极效果的有益细菌。它们能促进植物的生长，为植物提供它们生长所需的必要元素，如氮磷钾，还可以为植物提供生长激素IAA，增强植物的抗病以及抗逆能力。促生菌还拥有了一些化肥的作用，这样可以减少化肥的使用，对环境保护是十分有利的。促生菌包含了很多种类，这为我们提供了大量的研究材料，从中筛选出对植物促生作用最好的菌投入到日常生活以及生产中，对我国农、林业的发展以及环境保护都是十分有益的。

1.2促生菌的分类

1.2.1根际固氮菌

氮素对植物来说是不可缺少的一种重要元素，植物能否正常生长，植物产品的质量以及品质都需要植物能够吸收充足的氮元素来确保。植物主要得到氮源的途径是通过自生固氮或者和其它微生物联合固氮。与植物联合固氮的微生物就叫做根际固氮菌。根际固氮菌分为三类：自生固氮菌、共生固氮菌和联合固氮菌。自生固氮菌是一类独立性很强的细菌，它们能直接固定大气中的氮来合成自身所需的物质或者进行光合自养。一般自生固氮菌多为杆菌，并且有荚膜。在土壤中的分布范围十分广泛，在酸性环境分布很少。共生固氮菌对其他生物有很强的依赖性，必须和其他生物同生才能发挥固氮的作用。共生固氮菌和植物的生活紧密，由共生固氮菌的固氮作用使植物拥有能够从大气中直接固氮的能力。在共生固氮菌和植物的这个体系里，它们互利互惠，一者提供能源和碳源另一者提供氮源给对方。典型的有豆科植物中的大豆根瘤菌属等，非豆科的有蓝细菌属。联合固氮菌就是那些生活在植物根际的固氮菌。它们和前两种固氮菌的不同之处是有专一的寄生关系，与植物关系密切，但是不会和植物形成根瘤结构，这种固氮菌和植物之间的这种特殊的共生关系叫做联合固氮。联合固氮就的分布受地域的影响，不同的地域，分布的种类数量也不同。由于联合固氮菌和植物的联合不紧密，所以研究这个体系会遇到很大阻碍。生物固氮在我们的生活中起着非常重要的作用，人类的生存、繁衍，以及农业的发展都离不开生物固氮这一项先决条件。所以研究根际固氮菌是十分必要的，也能使我们受益无穷。

1.2.2根际解磷菌

磷也是一种对植物十分重要的元素，我们经常通过施肥来给植物补充磷元素，长期的使用化肥会使重金属堆积，土壤的酸碱平衡失衡，久而久之土壤便失去了肥力。其实突然中含有很多磷(如矿物质中含有磷酸盐)，但这些磷不能被植物直接吸收。在植物的根际有这样的细菌能将不能被植物吸收的磷分解为可以被植物吸收的磷。这样提高了植物对磷的吸收率，减少了化肥的使用，对环境的保护十分有益。这种能分解不溶磷为可溶磷的菌叫做解磷菌或者是溶磷菌。解磷菌在不同土质、有机物含量不同的土壤中的分布数量也不一样。早在90年代，我国科学家尹瑞玲就已经对水分稀少的土壤中的解磷菌进行过研究，发现解磷菌占土壤微生物数量的比例比较大，最大能达到80%以上。但又有研究表明处于植物根际的解磷菌含量并不高，因为定殖于植物根际的微生物有很多种，且这些微生物之间存在着竞争关系，因此可以看出解磷菌在植物根际不是强势的菌群。

1.2.3根际解钾细菌

植物缺钾并不是土壤里的钾含量少，而是因为土壤里的有效钾(能被植物吸收利用的钾)含量少。解钾菌就解决了这一问题，能将钾长石中的钾和黏土层中的缓效钾溶解为可以被植物吸收的钾。解钾菌能够活化土壤，使本来缺钾的植物能够吸收足量的钾元素正常生长发育。解钾菌也是一种重要的对植物有益的生活在植物根际的细菌。

1.3根际菌的作用机制

一些已知的PGPR可能对植物有益的机制有：

1. 通过隔离有毒重金属物质和降解异种植物来生物修复受重金属污染的土壤，产生生物化合物和改良的土壤结构。
2. 合成酶ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸酯）脱氨酶，这是一种参与降低发育中植物根部应激诱导乙烯水平的酶。
3. 通过生物固氮提供植物的N2。
4. 产生铁载体。
5. 生成植物激素（例如ABA（脱落酸），GA（赤霉素），生长素即吲哚-3-乙酸(IAA)和CK（细胞分裂素）。
6. 通过不同机制控制植物病原体，胞外酶水解真菌细胞壁，在根际内竞争营养物(生态位)，诱导系统抗性(ISR)和抗生素和铁载体的产生。
7. 营养物质的溶解和矿化，特别是矿物磷酸盐。
8. 改善非生物抗性。

1.4植物根际促生菌的应用

1.4.1减少过量的乙烯生成

作为植物正常生长和生长的重要调制器，在所有高等植物对环境胁迫的反应中都产生了乙烯。例如,植物暴露在压力条件下会产生过量乙烯，如重金属、盐度、干旱和营养失衡已经被报道。乙烯是植物生长发育的重要激素。但在高浓度时，包括在压力条件下，会导致植物生长的问题。由于“应力乙烯”的产生，所有植物的生长和产量(减少根和芽的生长)都受到压力条件的影响(如干旱、盐度、重金属毒性、营养失衡等)的减少。促进植物生长的最重要的细菌生理特性之一是拥有ACC脱氨酶。这种酶在压力条件下支持植物生长，植物内部的乙烯浓度可能会达到抑制植物生长的水平。研究人员已经表明，具有ACC脱氨酶的PGPRs可分解ACC为植物乙烯前体，从而降低压力植株的乙烯生产水平^[1]。换句话说，这些PGPRs作为ACC的接收器。ACC脱氨酶在土壤细菌中比较常见。ACC脱氨酶阳性细菌已经从不同的土壤中分离出来。例如，在49个铅(Pb)耐药菌中，有7个从耐金属的鸭跖草属中分离出来，生长在Pb和锌(Zn)尾矿，而在Cu废矿区生长的耐铜植物中分离出的100个cupper (Cu)抗性内生菌中有8个显示ACC脱氨酶活性^[2]。在秦等人(2014)的研究中，在沿海盐渍土生长的一种沿海盐生植物中，从不同组织(根、茎、叶)获得的126种菌株中，有13种菌株含有这种酶活性。此外，从不同的生态系统中采集的非根际和根际土壤中分离出的9种耐干旱荧光菌株之一。ACC脱氨酶生产PGPRs被认为是提高不同植物抗压能力的有效候选者。据报道非生物胁迫(如盐度、干旱和重金属) 对根系生长和代谢有不利影响，比如反过来又影响光合作用的过程^[3]。因此，根系统结构的动态调制(RSA)可以被认为是对抗应力的最重要的防御机制之一。研究发现PGPRs(例如，ACC脱氨酶产生菌)可以在RSA中引起改变(例如，增加根尖和根表面积的数量)，然后增加根系在应力条件下降低应力乙烯。由于乙烯的减少导致根系的增加导致植物从土壤深处获得水分和养分，因此，植物在压力条件下生存的时间更长。据报道，PGPRs生产的ACC脱氨酶和随后的乙烯产量降低是促进植物生长和耐受盐度和干旱胁迫的主要原因^[4]。由于在封闭的细胞内离子环境的干扰下，植物的养分在盐度和干旱胁迫条件下均衡损失。据报道，在矿物质营养缺乏压力的条件下，营养物质在根系形态(例如增加根毛的数量)的作用被破坏，因为压力乙烯可以改变土壤对养分(P)可用性的根系结构。因此，植物能够在这些有能力增加元素可用性的压力条件下生存(例如，N, P, K, Fe，等等)。正如上面所讨论的，通过降低应力乙烯水平，生产ACC脱氨酶的PGPRs可以增加植物根系，这也增加了根系分泌物的数量。一方面，根际分泌物由于由于有机酸和各种螯合剂帮助提高可用性的一些营养成分，另一方面，它们可以吸引一些有用的异养微生物。在一项研究中发现，与未接种的植物相比，产生ACC脱氨酶的玉米植株吸收了更高的氮、磷和钾，从而提高了植物的K /Na 比例，从而提高了盐度条件下的植物生长。通过减少乙烯的生物合成，从而增加植物的共生和固氮，ACC脱氨基的PGPRs可以刺激豆科植物的根瘤。例如，ACC 脱氨酶在干旱条件下增加了豌豆植株的N含量。植物中N含量的增加是由于这种细菌的乙烯产量下降，随后是根瘤增加。在重金属的胁迫下，最著名的作用机制之一也就是ACC脱氨酶的产生。众所周知，这些细菌增强了植物在重金属污染土壤下生长的能力。通过ACC 脱氨酶生产的PGPRs还原乙烯有助于减轻重金属的毒性，并对植物产生耐受性。一般来说，上述研究表明，ACC脱氨酶产生的PGPRs可以通过减少压力诱导的乙烯的产生，导致植物对各种胁迫的抗性增加。根据之前的研究，生产ACC脱氨酶的能力是减少非生物胁迫的最重要的细菌特性之一，在任何其他评估之前，细菌首先应筛选其产生这种酶的能力。此外，该领域还很少对生产ACC 脱氨酶PGPRs来缓解非生物胁迫的能力进行测试，这需要进一步的研究。

1.4.2改变植物激素的含量

众所周知，植物激素如脱落酸，植物生长素，油菜素类固醇（BRs），赤霉素和细胞分裂素通过广泛的适应性反应帮助植物适应非生物胁迫。然而，非生物胁迫对植物生长的抑制作用之一是由于这些植物激素的内源性水平下降^[5]。 一些PGPRs可以通过合成和分泌植物激素来平衡植物激素的水平，从而在胁迫条件下促进植物生长。例如，在干旱胁迫下，PGPR通过改变植物激素含量例如IAA，赤霉素，细胞分裂素，乙烯和脱落酸来增强植物对干旱的耐受性。在以前的研究中，赤霉素生产细菌在干旱和盐度条件下增强了黄瓜和大豆植物的生长。在由Arkhipova等人进行的研究中^[6]，细胞分裂素产生菌能够刺激莴苣和侧柏植物的苗生物量，并提高它们对干旱胁迫的抗性。脱落酸导致气孔关闭以减少水分的蒸腾损失，并且通过在盐水和干旱条件下介导根进行分支来增加水分吸收。对于由细菌产生的植物激素，IAA是非常重要的。正如以前的研究所表明的那样，IAA通过加强各种细胞防御系统的协调来提高对外部不利条件的保护水平。如前所述，干旱和盐分等非生物胁迫不利地影响根部，导致根部生长减少。另外，由于营养元素通过根部从土壤中吸收，因此认为良好的根部生长是增加植物生长的先决条件。在植物生长促进性状中，IAA合成被认为是刺激植物生长的最重要机制之一。在80％的根际细菌中报道了产生这种光敏色素的能力。这些细菌通过不同途径从L -Trp（L-色氨酸）产生IAA。众所周知，产生IAA的PGPR通过改变预期的RSA（例如增加根尖数目和根表面积）来增加植物获得营养物质和水分的能力（提高水分利用效率）并增强它们的吸收，以减轻植物盐分和干旱胁迫的影响^[7]。例如，产生IAA的PGPRs如假单胞菌在缓解绿豆和葡萄植物中的干旱胁迫以及产生IAA的PGPRs如P.oraphoraphis和Enterobacter spp中的作用^[8]。减轻黄瓜和番茄植物的盐胁迫已有报道。大多数植物已适应了必需营养缺乏的条件。例如，在低磷土壤溶液中，植物具有克服磷缺乏并增加其可用性的策略，例如增加根系，用特定分泌物（例如通常有机酸或酶）改变根际，抑制初生根生长，促进侧根生长，增强根毛发育，并形成根簇。众所周知，上述策略通常效率不足以满足植物的需求，特别是在石灰质和碱性土壤以及处于压力条件下。因此，假定P对根表面的供应和可用性受根系和微生物过程的影响。植物相关的PGPR通过调动营养素并使其可用于植物根部来改善植物营养获得。例如，溶磷细菌（PSB）可通过降低根际土壤的pH值，从而使植物吸收磷，从而溶解各种微溶磷源，如磷酸钙和磷酸锌，其具有低溶解度。通过增加根系和根系分泌物，产生IAA的PGPRs可以在植物中或植物上定植自身或其他细菌中发挥作用^[9]。正如已经确立的那样，细菌IAA对植物的主要作用之一是根系和根分泌物的生长，这又导致根表面上细菌的生长和种群增加（根毛）和根际。此外，通过增加根系生产IAA的PGPRs可以为其他PGPR的定殖提供更多的活性位点^[10]。由于几乎所有的植物生长促进细菌（如溶磷细菌，产铁细菌，固氮细菌等）都是异养的，根分泌物中的含碳化合物是这些细菌的最佳能源。因此，可以认为随着细菌分泌的IAA诱导根分泌物的增加，这些细菌的种群也可以在根际增加。增加根部磷溶解细菌，铁载体产生菌和根际土壤中固氮细菌的数量，反过来又会导致植物可利用的磷，铁和氮等养分分别增加。 另一方面，由于具有有机酸，质子，植物营养素，酶（例如木聚糖酶，磷酸酶，RNase，聚半乳糖醛酸酶，蛋白酶，蔗糖酶和脲酶）和螯合剂 ^[12]， 还可以增加根际中的不溶性元素（如P和微量营养素）的量。例如，接种带有产生IAA的PGPRs的苜蓿，由于这些细菌释放有机酸，导致植物在磷酸盐缺乏时更好地生长。参与细菌和植物之间相互作用的最重要的细菌代谢物是 IAA激素。这种激素也可以有效促进植物生长和根结瘤。例如，具有降低的IAA合成水平的慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii）细菌的突变体比野生型减少了大豆根中的根瘤。前结节的N2固定能力也下降。在受重金属污染的环境中，产IAA的细菌还能够通过增加植物生长（稀释作用）来缓解植物中的重金属诱导应激，引起植物生理学变化，增加必需元素的吸收并减少对植物的吸收重金属（通过与存在于细菌IAA诱导的根分泌物中的螯合剂形成复合物）。例如，生长素（例如IAA）通过减少Cd吸收和易位或刺激抗氧化酶参与减轻植物对Cd的毒性。一般来说，由于在减轻植物盐度，干旱，营养失衡和重金属毒性的压力方面具有多重潜力，IAA的产生可能是未来最佳的细菌培养物生产和生物肥料生产的良好选择^[13]。 以前的大多数研究集中在细菌IAA在减少环境压力方面的作用。 研究细菌产生的其他激素在减少环境压力方面的作用被提出用于未来的研究。 研究PGPRs如何调节植物激素和次生代谢产物的水平和初始适应性反应也是未来一个有趣的研究领域。

1.4.3改善必需矿物元素的吸收

与盐胁迫类似的干旱胁迫会破坏植物对植物必需元素的吸收和转运，最终导致植物的氧化胁迫。有毒重金属会干扰植物必需营养素的吸收和分配，造成营养素缺乏和不平衡。农业环境中营养物质的低水平(可用性)是植物生长的主要制约因素之一^[14]。 在热带地区这是非常严重的，这些地区的营养素含量很低。在以前的许多研究中，已经表明，胁迫植物需要额外的营养物质来减少环境胁迫的不利影响，众所周知，这是解决这些压力的最实际和最简单的方法。已知良好的营养管理可以极大地影响植物适应非生物胁迫的能力条件。植物相关细菌已被证明对许多方面的根际植物营养物循环至关重要，从而增加了土壤微生物群落和植物的养分利用率，并减少了对化肥的需求.N是植物发育的必需元素，限制了自然和农业生态系统的养分。PGPRs可以通过共生和非共生N2固定，土壤中有机形态N的矿化，以及通过产生植物激素IAA和ACC脱氨酶而增加植物的根系来增加植物对氮的吸收。在N之后，最经常限制植物生长的基本矿物元素是P，其被吸收为一元（H₂PO₄^-）或二元（HPO₄ ^2-）可溶形式^[15]。（例如，吸附到土壤矿物表面或作为微量有效沉淀物，掺入生物质内并与土壤有机质有关），因此尽管存在土壤中无机和有机磷形式丰富,土壤中大多数P是生物无法获得。PGPR在土壤P循环的所有三个主要组分中都起着重要作用。一般而言，PGPR可通过酸化，螯合，交换反应，络合或矿物质溶解化合物（例如有机酸阴离子，质子，氢氧根离子和CO₂）的释放，铁载体的分泌，IAA产生等将不溶性磷酸盐转化为可用形式。ACC脱氨酶活性，胞外多糖（EPS）的产生，有机酸的释放（通过降低pH和阴离子交换或与Fe或Al结合，使P可用于计划）和无机酸，并通过分泌各种不同的细胞外磷酸酶来催化磷酸酯的水解而使有机磷酸盐矿化^[16]。值得注意的是，每种PGPR可以以一种或多种方式起作用以引起不溶性磷的溶解。在植物生长和发育中起重要作用的主要常量营养素之一是钾。所有农作物都需要足够的钾肥50-300kg /公顷才能达到最高产量^[17]。尽管土壤中K的储量很大，但已经表明大多数土壤K不能直接用于植物吸收。由于施肥不平衡，作物集约化，钾肥施用量低，径流，土壤侵蚀，淋溶，绿色革命期间高产作物品种和杂交种的引入以及不溶性钾源的存在，植物对钾的利用率正在下降。因此，钾缺乏目前被认为是作物生产的限制，并且已经表明大多数作物对土壤中使用钾肥有反应。在这种情况下^[18]，PGPRs在现代农业中对于可持续作物生产越来越重要，它可以通过它们的活动提高土壤中钾的有效性。解钾菌（KSB）的使用是满足作物钾需求的有效技术之一。已知KSB通过将矿物K转化为可利用的K在向植物提供K中具有重要作用。此时，关于KSB用于溶解K的机制的信息很少。已经发现影响K的溶解的许多因素，包括参与溶解含K矿物的微生物的类型，土壤的营养状况，数量，大小和土壤含钾矿物的类型，环境因素等。以前的研究表明，PGPRs使用的钾增溶的作用机制与磷增溶的作用机制几乎相似^[19]。 通常，KSB通过生产荚膜多糖，羟基阴离子，胞外多糖，铁载体，有机配体，胞外酶，合成有机和无机酸以及在根际矿物表面形成生物膜，可以溶解含K的矿物质并释放K。除了从含K矿物中释放K以外，一些称为硅溶解增溶细菌的PGPRs（即芽孢杆菌属，伯克霍尔德菌属和假单胞菌属）能够从硅酸盐矿物中溶解硅。有机酸，特别是葡萄糖酸似乎是溶解硅酸盐矿物质如长石，白云母和黑云母的最有效的活性剂。众所周知，硅还可以通过作用机制缓解植物中不同的非生物和生物胁迫。PGPRs可以通过不同的方式增加植物的微量营养素（Fe，Mn，Zn，Cu等）的利用率，如降低土壤pH和螯合剂^[20]。铁（Fe）是一种重要的微量营养元素，在干旱和石灰性条件下尤其缺乏植物，产生铁细胞的PGPRs菌株可以提高铁营养。大多数与植物有关的PGPR产生响应于根际中低Fe含量而称为铁载体的铁螯合剂。铁载体是低分子量的有机化合物，它具有很高的亲和力以结合一些元素如Fe³ 以及其它金属离子并增加其对植物的可利用性。由铁载体提供Fe的另一个理论是配体交换。由于植物甾体培养基与细菌铁载体相比具有较高的Fe³ 结合能力，因此与细胞铁载体结合后（通过配体交换反应）细菌铁载体提供的Fe被吸收由植物^[21]。据报道，一些PGPRs增加了植物对锰（Mn）的利用率。例如，芽孢杆菌属，假单胞菌属和土壤杆菌属等PGPRs可以将氧化的Mn⁴ 还原为Mn² ，Mn² 是对植物有代谢作用的化学形式。通过影响植物生长并因此影响植物根系分泌物，这些PGPRs能够增加土壤中锰的有效性。源自细菌活性的根分泌物的增加进而提供将MnO2还原为Mn² 所需的电子（通过根分泌物中存在的碳质化合物的分解）和质子（通过根细胞的质子排泄系统）^[22]。此外，根和PGPR产生与Mn，Fe和其他元素形成可溶性复合物的螯合剂（酚类化合物和有机酸），从而避免其再沉淀。通过生产影响植物生长的不同化合物（如羧酸盐和酚类化合物），影响植物生长和增加根系分泌物的产生，PGPR可以提高营养贫乏土壤中铜（Cu）和锌（Zn）的利用率。在生物体系中有着重要的作用，因为它是生物体中许多硒蛋白的主要成分。除了为植物提供必需的营养素之外，一些PGPR（例如，类芽孢杆菌属，芽孢杆菌属，克雷伯菌属，不动杆菌属，嗜麦芽寡养单胞菌属，肠杆菌属和假单胞菌属）可以显着增加累积硒在植物中的应用。根据以前的研究，硒细菌（硒耐受菌）不仅可以增加硒向芽的转运并最终提高谷物的硒含量，而且还能保护植物免受胁迫并消除产生的压力这些细菌还表现出PGP性状如ACC脱氨酶活性，P溶解和IAA产生，并且可以增加植物中其它营养物质如Ni，Mn，P，Mo，K，Fe和Ca的积累^[23]。另一种机理其中重金属抗性-PGPR能够减少重金属对植物的毒性效应是通过改善必需营养元素（例如Mg，P，Ca，N，S，Fe，Zn，Mn等的吸收。）因此，增加这些植物对重金属的抗性。例如，通过向金属胁迫植物提供营养物质（特别是Fe），降低植物根部周围的自由基形成以及保护微生物植物激素免于金属诱导的氧化损伤，重金属抗金属PGPR产生的铁载体可以减轻金属诱导的应激根据PGPRs PGP特性的特点，IAA和ACC脱氨酶活性的产生在胁迫条件下为植物提供营养物质的作用更为突出。根系是第一个在胁迫下生长显着降低的器官，如盐度，干旱和重金属，导致营养物质摄取减少。如上所述，产生IAA的PGPRs和含有ACC脱氨酶的PGPRs可以通过增加胁迫条件下的根系来增加植物对营养物质和水的获取^[24]。由细菌产生的IAA诱导的根系增加引起的根分泌物增加还可以增加根际中的营养物例如P和微量营养素的可吸收性。存在于根分泌物（例如有机阴离子）中的各种螯合剂可通过螯合它们来减少重金属的吸收。一般来说，上述研究表明PGPRs，特别是产IAA的细菌，可以在不同的胁迫条件下为植物提供营养物质的可利用性，从而防止植物生长受到严重影响。未来研究的一个方面可以帮助选择有效的PGPRs来增加植物营养物的可分性，即确定影响这些细菌在胁迫条件下吸收养分的效率的因素。研究PGPR对营养物质形态和动态变化的影响并根据这些变化来确定这些变化是否影响到营养元素的特殊形式或根际中所有形式的元素对今后的研究都是必要的。 PGPRs对根系形态的影响与PGPRs对盐度和干旱的耐受性之间的相关性的细节并不清楚，这需要进一步的研究来阐明。此外，在重金属和盐胁迫条件下，还不知道植物吸收哪种营养元素最受PGPRs的影响。解决这个问题可以更好地帮助管理受重金属污染的土壤和受盐影响的土壤。

1.5植物根际促生菌的研究现状

许多年前，研究人员对PGPRs的使用感兴趣，以增加植物的生长和产量。然而，这些有益菌在非生物胁迫管理中的作用近年来得到了重视。现在有几项研究证明了PGPRs可以通过多种方式使农业植物在不同的压力环境下维持生产力例如，PGPRs被认为是植物盐胁迫改良的有效候选者^[25]。各种PGPRs属植物，包括假单胞菌、芽孢杆菌、黄杆菌、偶氮菌、克氏杆菌、无色菌、芥子菌、慢热菌、气单胞菌、醋酸杆菌等，均已在盐渍土栽培的不同作物中保留其产量^[26]。关于这些属的一个有趣的观点是，即使在高盐浓度的情况下，它们仍然保持着它们的PGP特征。据报道，一些PGPRs在植物中诱导耐旱性。PGPRs诱导的植物抗旱性的机制，通过诱导的所谓的根菌诱导的干旱耐力和恢复过程，涉及到各种生理和生化变化^[27]。在PGPRs介导的盐度和干旱耐受性中也发现了类似的作用机制。PGPRs使农业植物能够保持生产力。

近年来，耐重金属性的PGPRs也增加了被重金属污染土壤中的植物的生长。这些PGPRs在促进植物生长的同时，也在减少土壤中各种重金属产生的压力。PGPRs生产植物生长调节剂、植物激素和各种此生代谢物，诱导植物生长发育，减轻重金属的毒性 ^[28]。在重金属的胁迫下，许多PGPRs都能减轻重金属的毒性并促进植物生长。PGPRs通过影响营养物的溶解度和吸收(例如，增加磷和铁的溶解度)，在营养失衡的条件下，增加了植物营养的可用性。在根际的营养输送和植物激素的生产，特别是IAA的生产，ACC脱氨酶活性，含铁细胞的生产和磷酸盐的溶解都可以解释植物的抗压能力。PGPRs可用于提高作物植物的生存能力，并在营养不良的环境中产生产量。例如，细菌IAA诱导的根系结构的改变可能导致根总表面积增加，从而改善养分和水分的吸收，这可能对整个植物生长有积极的影响^[29]。由于这些PGPRs提供了很好的模型来理解抗压能力、适应性机制和反应，它们也可以被改造成作物来应对各种生物和非生物胁迫以及气候变化引起的压力。有关植物生长的一些关键挑战是环境非生物压力,限制作物产量,评审的目的是总结的行动机制PGPRs可能增加植物对缓解非生物胁迫的抗性,如盐度、干旱、重金属毒性、和营养失衡并确定承诺未来的研究^[30]。以往的研究表明，PGPRs具有多重PGP特性，可以缓解作物植物中不同类型的非生物胁迫。有许多评论文章认为，通过各种机制，PGPRs可以缓解植物的非生物胁迫^[31]。然而，植物生长促进特性在缓解大多数环境胁迫中发挥着关键作用，这一点并不为人所知。

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1土样

用于分离、筛选促生菌的供试土样，采自长江中下游地区不施肥，施用有机肥，施用化肥的3种施肥处理的番茄生长中期的根际土，采样时间为2018年2月28日。

2.1.2筛选培养基：

1. Ashby无氮培养基（1L）

甘露醇10 g，KH₂PO₄ 0.2 g，MgSO₄ 0．2 g，NaC1 0.2 g，K₂SO₄ 0.3 g，CaCO₃5 g，水1000 mL，Agar 15 g。

1. NFB固体培养基（1L）

苹果酸 5.0，K₂HPO₄，0.5g， MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.02g；溴麝香草酚蓝（5g/L即取5g溴麝香草酚蓝溶于0.2N的KOH中）2mL；FeEDTA (溶液16.4 g /L)4 mL；维他命溶液（生物素，10mg；盐酸吡哆醛，20mg，加热溶解后，用蒸馏水定容至100mL）1 mL KOH 4.5 g；微量元素溶液2mL；琼脂，15g；最后加入蒸馏水定容至1L；用0.1M的 NaOH将其pH调至6.5。

1. 固氮培养基（1L）

KH₂PO₄，0.2g；K₂HPO₄，0.8g；MgSO⁴·7H2O，0.2g；CaSO₄·2H₂O，0.1g；FeCl₃，微量；Na₂Mo₄·2H₂0，微量；酵母提取物，0.5g；甘露醇，20g，琼脂，15g，pH7.2。微量试剂：取1g溶于1L纯水中,配成1g/L的母液，配培养基时，取1mL放入培养基中。

2.1.3分离纯化培养基

1. 分离培养基：NFB3x固体培养基（1L）

苹果酸 5.0，K₂HPO₄, 0.5g; MgSO₄·7H₂O 0.2g， NaCl 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.02g；溴麝香草酚蓝（5g/L即取5g溴麝香草酚蓝溶于0.2N的KOH中）6mL；FeEDTA (溶液16.4 g /L)4 mL；维他命溶液（生物素，10mg；盐酸吡哆醛，20mg，加热溶解后，用蒸馏水定容至100mL）1 mLKOH4.5 g；微量元素溶液2mL；琼脂，15g；酵母浸出物50mg；最后加入蒸馏水定容至1L；用0.1M的 NaOH将其pH调至6.5。

1. 纯化培养基：BMS培养基（1L）

马铃薯，200g；苹果酸，2.5g；KOH,2g；结晶蔗糖2.5g；维他命溶液1mL；微量元素溶液2mL；溴麝香草酚蓝溶液2滴；琼脂，15g；将土豆置于纱布袋中，在0.5L水中煮沸30分钟，然后通过8层纱布过滤，收集滤液。将苹果酸溶于50mL水中并加入溴麝香草酚蓝。加入KOH直至苹果酸溶液是绿色的（pH 6.8-7.0）。 将该溶液与结晶蔗糖，维生素和琼脂一起加入马铃薯滤液中。 用蒸馏水将最终体积加至1L。 将培养基煮沸溶解琼脂，然后通过高压灭菌进行灭菌。

2.1.4发酵培养基

LB 培养基（1L）：酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0 g，NaCl 10.0g，琼脂粉15.0~20.0g。

2.1.5比色液

0.5 mol/L FeCl₃溶液10mL、 35％高氯酸500 mL ，于使用前混合摇匀，避光保存， l mL试液应加此试剂2 mL。

2.1.6微量元素溶液(1L)

CuSO₄·5H2O, 0.04g; ZnSO₄·7H2O, 0.12g; H₃BO₃,1.40g; Na₂MoO₄·2H2O, 1.0g; MnSO₄.·H₂O, 1.175g；

2.1.7实验仪器

2.2实验方法

2.2.1促生菌的筛选及纯化

取10g番茄根际土壤溶于90 mL盐溶液中，震荡1h，使土壤完全溶解在盐溶液中，配成10^-1的稀释液，接着取10^-1的稀释液10mL，放入装有90mL盐溶液的瓶中，配成10^-2的稀释液，以此类推。分别配成10^-3，10^-4，10^-5的稀释液。取不同浓度的稀释液0.5 mL，放入含有5 mL半固体NFB培养基中，轻轻摇匀，每个浓度的稀释液3个重复，在28℃下培养2-7天，每天观察其生长情况，看半固体培养基中是否有薄膜产生，直到液体表面有明显的薄膜生成。用接种环挑取薄膜在NFB3x固体培养基划线，然后再28℃下培养2-5天，观察其形成的菌落，然后待长出菌落，按照形状大小色泽等生理性状的不同挑取单菌落分别划线接种到BMS培养基上，以此重复直至获得纯的菌株。用20%的甘油在-80℃保藏菌株

2.2.2促生菌的鉴定

将高效菌株和菌体分别接种到无氮培养基平板上,20℃倒置培养。观察菌落形态特征。以枯草芽胞杆菌和大肠杆菌为对照涂片,进行革兰氏染色并观察菌体形态以及有无芽胞。利用油镜技术观察菌体形态。

2.2.3促生菌株 DNA 水平鉴定

(1)引物 27F AGTTTGATCMTGGCTCAG

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