论文总字数：20475字

摘 要

蔗糖磷酸化酶是在工业生产中具有重要的应用价值的催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。但野生菌株获得的酶产率和热稳定性低，且在大肠杆菌中以胞内酶形式出现，难以满足大规模的工业化生产。

本论文将携带嗜热蔗糖磷酸化酶基因质粒的重组甘油菌活化，提取质粒并验证后，将其转化进大肠杆菌BL21(DE3)，通过 IPTG 诱导使其在大肠杆菌中表达。并对重组菌的生长情况，以及胞外与胞内粗酶的蛋白质浓度、酶活、SDS-PAGE凝胶电泳结果等进行对比，分析重组嗜热蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌BL21(DE3)体内分泌表达的能力。

本论文构建了三种重组菌，即TSPase,OmsYHE-TSPase,OsmYE-HTSPase。并通过SDS-PAGE电泳分析TSPase重组菌可以分泌表达胞外酶，且随着诱导时间的增加，目标蛋白量增加，但胞内酶量不随诱导时间的改变而增加。TSPase重组菌细胞内酶的酶活为8.6 U/mg，远大于胞外酶的酶活0.34U/mL。而OsmYHE-TSPase和OsmYE-HTSPase胞内酶中基本无可溶性目的蛋白，使得重组菌不分泌目标胞外酶。所以融合OsmY序列使目标酶失活，形成了不溶性包涵体，并没有达到促进分泌表达的效果。

关键词：蔗糖磷酸化酶 分泌表达 OsmY

ABSTRACT

Sucrose phosphorylase is an enzyme which can catalyze the transfer of glucosidic bonds and has important application value in industrial production. However, the enzyme yield and thermal stability obtained by wild strains are low, and they appear as intracellular enzymes in E. coli. So it is inappropriate for large-scale industrial production.

In this thesis, the recombinant glycerol bacterium carrying thermophilic sucrose phosphorylase gene plasmid is activated, and after the plasmid is extracted and verified, the recombinant plasmid is transformed into E. coli BL21(DE3) and expressed in E. coli by IPTG induction. The growth of recombinant bacteria, protein concentration, enzyme activity and SDS-PAGE gel electrophoresis results of extracellular and intracellular crude enzymes were compared to analyze the expression and secretion ability of recombinant thermophilic sucrose phosphorylase in E. coli BL21(DE3).

In this paper, the recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3) and three recombinant strains were constructed. SDS-PAGE analysis showed that TSPase recombinant bacteria could secrete and express extracellular enzymes, and the amount of target protein increased with the increase of induction time, but the amount of intracellular enzymes did not increase with the change of induction time. The activity of TSpase enzyme in extracellular was 8.6 U/mg, which was higher than that in the cell 0.34 U/mL. However, the intracellular enzymes of OsmYHE-TSPase and OsmYE-HTSPase are basically free of soluble proteins of interest, so that the recombinant bacteria do not secrete target extracellular enzymes. Therefore, the fusion OsmY sequence inactivates the target enzyme and forms insoluble inclusion bodies, which does not achieve the effect of promoting secretion expression.

Key words: sucrose phosphorylase; secretion and expression; OsmY

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 蔗糖磷酸化酶 1

1.1.1 性质与应用 1

1.1.2 重组嗜热蔗糖磷酸化酶 1

1.2 大肠杆菌 1

1.2.1 大肠杆菌的特点 1

1.2.2 大肠杆菌表达系统 1

1.2.3 大肠杆菌重组蛋白分泌表达的优势 2

1.3 大肠杆菌分泌表达异源蛋白系统的分类 2

1.4 促进大肠杆菌分泌表达异源蛋白方法 2

1.4.1 信号肽的序列与重组蛋白分泌能力 2

1.4.2 共表达对重组蛋白分泌能力的影响 2

1.4.3 融合表达对重组蛋白分泌能力的影响 3

1.4.4 表达宿主对重组蛋白分泌能力的影响 4

1.5 本论文促进大肠杆菌分泌表达的方法 4

1.6 本论文的研究意义和主要研究内容 4

1.6.1 研究意义 4

1.6.2 研究内容 4

第二章 嗜热蔗糖磷酸化酶的重组表达及其酶学性质研究 6

2.1 前言 6

2.2 实验材料 6

2.2.1 质粒与菌株 6

2.2.2 实验试剂 6

2.2.3 实验仪器 7

2.2.4 试剂盒 8

2.2.5 培养基 8

2.3 实验方法 8

2.3.1 重组菌培养与表达 8

2.3.2 粗酶的获取 9

2.3.3 蛋白浓度测定 9

2.3.4 SDS-PAGE凝胶电泳 9

2.3.5 酶活力测定 10

2.4 结果与分析 11

2.4.1 核酸胶验证结果 11

2.4.2 重组菌的生长情况 11

2.4.3 重组 SPase 的表达 12

2.4.4 TSPase分泌表达能力 14

2.5 本章小结 14

第三章 结论与展望 16

3.1 结论 16

3.2 展望 16

参考文献 17

致谢 21

文献综述

蔗糖磷酸化酶

性质与应用

蔗糖磷酸化酶（SPase，Sucrose Phosphorylase，EC 2.4.1.7）能够催化转移葡萄糖苷键，是催化糖苷合成的一类重要的酶^[1]。该酶以蔗糖或1-磷酸葡萄糖为供体，传递到相应的受体^[2]，如酚羟基、羧基等^[3]，催化各种糖苷的合成。该酶可利用淀粉、蔗糖、乳糖等价格低廉的原料，合成商业价值更高的产品，在食品、化妆品添加剂等行业均有应用。

重组嗜热蔗糖磷酸化酶

蔗糖磷酸化酶虽然具有良好的受体特异性，但由于热稳定性差，限制了其工业应用。因此如何提高其热稳定性是当前研究的热点之一^[4]。热稳定酶在工业应用中具有许多优点。 例如，反应效率随着温度的升高而增加，从而改善了反应过程和下游纯化过程的经济效益。嗜热菌一直是热稳定酶^[5]的主要来源^[6]，Verhaeghe 等^[7]为了获得热稳定性较强的酶， 从嗜热菌Thermoanaerobacterium中鉴别出蔗糖磷酸化酶，该酶在60℃下的半衰期达到60 h。于丽^[8]等人对长双歧杆菌蔗糖磷酸化酶进行了生物信息学分析，得到用于突变的目标位点，并对突变酶进行了重组表达、纯化和性质研究，验证获得了稳定性提高的突变酶。

大肠杆菌

大肠杆菌的特点

大肠杆菌是自然界最著名的生物之一^[9]。它具有通用背景清晰、复制速度快、成本低、表达高、易纯化表达产品等优点。它是大多数科学研究和应用开发中蛋白质表达的首选菌株。

大肠杆菌表达系统

大肠杆菌表达系统是目前最流行的表达系统之一。研究通常选择多种质粒载体和宿主菌组合，以得到高产量蛋白。研究一般要从表达蛋白的应用领域，已知信息、克隆策略等多种要素来选取用作表达的质粒载体。而宿主菌株中最经典的是蛋白酶基因缺陷型菌株—大肠杆菌BL21 系列。该系列菌株添加了T7RNA聚合酶基因。用IPTG诱导了T7 RNA聚合酶，并对其序列和靶蛋白进行了特异性鉴定，并且该转录体系的专一性很高。虽然乳糖诱导表达目的蛋白的效果比不上IPTG，但是乳糖价格低廉，安全无毒。同时可以作为碳源^[10]促进菌体的生长^[11]。

大肠杆菌重组蛋白分泌表达的优势

重组蛋白作为大肠杆菌的外源蛋白^[11]，合成后有四种定位，即胞质、外周质、内外膜和细胞外基质。虽然对蛋白进行重新构建容易操作，而且重组蛋白可以在大肠杆菌中高效表达，能够满足对大量蛋白的需求，但是因为跨膜机制的不健全，翻译后修饰酶的缺失以及辅助蛋白折叠的因子的缺少等原因，蛋白不能自主分泌到细胞外，从而导致中间产物大量堆积，即形成不溶性包涵体^[11]。不溶性包涵体是没有生物活性的，想要利用就一定要经过变性和复性等繁杂过程，才能获得生物活性，难以应用于工业自动化生产。而通过蛋白的分泌表达可以克服这些缺点。

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