论文总字数：15073字

摘 要

众所周知，磁性材料是一种新型复合材料，其中磁性纳米材料更是在其中占有很重的位置。磁性纳米材料是一种非常新颖的复合材料，在靶向药物、酶固定化、生物分离还有磁热疗拥有比较多的应用范围。而磁性微球具有独特的生物亲和性、低毒性和巨大的比表面积，还兼有磁性材料良好的磁响应性，是目前研究的重点。固定化酶的技术是指用物理、化学等手段．将游离酶封锁在固体材料或限制在一定空间内进行特有的、活跃的催化作用，而且是可以回收重复使用的一种技术。本实验以四氧化三铁与壳聚糖为原料，以磁性微球为载体，采用物理吸附和共价结合法固定漆酶，考察各种条件对微球形貌、磁性的影响，并采用红外光谱图、电镜、粒径分析仪等方法对微球的形态和性能进行研究。

关键词：磁性微球、四氧化三铁、固定化、漆酶

Preparation and application of magnetic microspheres

Abstract

It is well known that magnetic materials are a new type of composite materials, in which magnetic nanomaterials occupy a very heavy position. Magnetic nano-materials are very novel composite materials, which have many applications in targeted drugs, enzyme immobilization, biological separation and magnetic thermotherapy. and magnetic microspheres with unique biological affinity, low toxicity and huge specific surface area, as well as good magnetic response of magnetic materials, is the focus of current research. The technology of immobilized enzyme refers to the use of physical, chemical and other means. blockade of free enzymes in solid materials or confined to a certain space for unique, active catalysis, and is a technique that can be recycled for reuse. in this experiment, iron trioxide and chitosan were used as raw materials, magnetic microspheres were used as carriers to fix laccase by physical adsorption and covalent binding. the effects of various conditions on the morphology and magnetism of microspheres were investigated. the morphology and properties of microspheres were studied by infrared spectroscopy, electron microscopy, particle size analyzer and other methods.

Keywords: magnetic microspheres, iron trioxide, immobilization, laccase

目录

摘要 I

Abstract II

第一章文献综述 1

1.1 引言 1

1.2 磁性微球简介 1

1.3 漆酶的固定化方法 2

1.3.1 吸附法 2

1.3.2 包埋法 3

1.3.3 交联法 3

1.3.4 结合法 3

1.3.5 新型固定化酶方法 4

1.4 磁性微球的载体 4

1.4.1 磁性壳聚糖微球载体 4

1.4.2磁性二氧化硅微球载体 5

1.4.3磁性碳球载体 6

1.5 磁性壳聚糖微球的制备 6

1.5.1 反相悬浮交联法 7

1.5.2 沉淀生成法 8

1.6漆酶载体负载量的检测方法 9

1.7酶活性测定方法 9

1.8固定化漆酶的应用 10

第二章实验部分 11

2.1 实验材料与仪器 11

2.1.1 材料 11

2.1.2 设备 11

2.2 实验内容 12

2.2.1 水热法制备Fe₃O₄ 12

2.2.2 磁性壳聚糖微球的制备 12

2.2.3 固定漆酶 13

2.2.4 载体负载量测定 13

2.2.5 酶活的测定 13

2.2.6 降解率的测定 13

第三章实验结果与讨论 14

3.1 Fe₃O₄的表征 14

3.2 磁性壳聚糖微球的表征 15

3.3 负载量结果分析 17

3.4 酶活结果分析 17

3.5 降解率结果分析 17

3.6 实验总结 18

第四章结论与展望 19

4.1 结论 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 22

第一章 文献综述

1.1 引言

壳聚糖是一种性能比较高的天然高分子材料.壳聚糖的前体：甲壳素，广泛存在于虾、蟹等等甲壳动物还有昆虫、藻类中,它是世界上第二大类天然高分子化合物. 壳聚糖是甲壳素脱乙酰基产物,分子链中含有反应性基团-OH,-NH2, 它在酸性溶液中就会形成阳离子聚电解质,显示出比较好的絮凝性能.并且,壳聚糖还具有很好的络合作用,使得其能与过渡金属离子、腐殖酸类物质及表面活性剂等产生络合,而且可以对水溶性有机污染物实现脱除.可是壳聚糖在实际应用中，存在着很多的不足,特别是对污染物经吸附脱除后,有时很难从水体中分离. 所以，寻找一种简单的分离方法对推进壳聚糖在水处理中的应用具有很大的意义.而在近些年来,磁分离技术已被应用到水处理的行业中。由于磁性物质在磁场中所受到的磁力比重力要大很多倍, 因此具有处理量大、占地面积小、液固分离效率高等好处.绝大多数的化合物包括壳聚糖是没有磁性的,如果要想通过磁分离技术进行处理, 必须有磁性.而通常的方法是通过将这类不具有磁性的化合物与磁性物质(Fe₃O₄等)结合,形成以磁性物质为核,非磁性材料为壳的核壳微球结构,从而实现对材料的磁性化,进而可采用磁分离技术达到快速分离的目的.把壳聚糖和磁性物质结合制备成磁性微球,除了保留了壳聚糖本身具有的吸附、络合等功能外,还有兼有易于分离的优点。

1.2 磁性微球简介

磁性微球具有非常良好的表面效应和体积效应, 相对于普通磁性颗粒材料，具体表现在其吸附平衡时间大大缩短、比表面积激增、微球官能团密度、选择性吸附能力增大等方面。并且,它具有良好的选择性磁响应性,在磁性Fe₃O₄晶体的粒径小于30nm时,具有超顺磁性,所以可避免在使用中的粒子之间发生磁性团聚现象;再者,它的物理、化学性质稳定,具备一定的机械强度与化学稳定性,能耐受一定浓度的酸碱溶液。其中的磁性物质不易会被氧化、磁性能不容易下降,具有一定的生物相容性,不会对生物体造成特别明显的伤害;而且,磁性微球表面本身有功能基团(如-OH,-COOH,NH₂等),可连接生物活性物质(如酶等)。

1.3 漆酶的固定化方法

漆酶的固定化是以无机、有机化合物为载体材料，采用物理、化学手法，将漆酶束缚或者限制于特定的空间中，令它在一定范围内进行反应，并实现分离回收循环使用的新技术。其固定化方法也也比较多。目前，漆酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、结合法、交联法等。

1.3.1 吸附法

吸附法反应条件温和，它制备的固定化酶保活性比较高，载体的不同会使固定化最佳条件也产生差异，而且很多的载体都可以吸附法固定化漆酶。以高分子为平台的碳材料、二氧化硅空心磁性微球为载体，结果显示其最佳固定化pH值4.5。此外，有人以介孔磁性二氧化硅为载体研究了介孔载体表面的孔径对漆酶吸附率的影响，发现当孔道半径大于生物大分子的 2倍时，最有利于生物大分子与载体相接触，其对漆酶的吸附量高达 294.4 mg/g。但是，在吸附法固定化漆酶时，酶与载体的相亲作用力并不强，固定化漆酶的循环利用受到了限制。

1.3.2 包埋法

包埋法是在载体和酶溶液混合之后，使用引发剂进行了聚合反应，在物理作用下将酶固定在载体的空间内，实现了酶的固定化。漆酶的用量会影响固定化酶的活性，固定化体系中最佳的p H值在4.0-5.0之间，该方法要使用薄膜技术，且可以控制膜的厚度。利用多孔超细纤维膜包埋漆酶，膜的多孔性有利于漆酶与反应底物充分接触反应，在平均空隙大小为10.92 nm 时，固定化酶的活性达到游离酶的67%。方法并不涉及酶的构象和分子结构的变化，而且反应条件温和，所以酶活性回收率高。但，由于阻力的影响，并不不适用于大分子底物的反应催化。

1.3.3 交联法

交联法是通过双功能、多功能的交联剂，使用化学键将酶蛋白分子和固定化载体交联结合，戊二醛是交联法中最常用的交联剂。交联剂既可以使酶的活性得到保存，又可以使固定化漆酶，并且循环使用。交联剂的用量，给酶量，固定化时间、固定化溶液pH值对固定化结果都有影响。当戊二醛浓度过大时，戊二醛分子间容易发生羟醛缩合反应，微球表面上过多的醛基会与漆酶反应，影响漆酶的构象，使漆酶的活性受到一定的负面影响。现以磁性壳聚糖微球为载体研究，发现交联剂最佳浓度为 8%。以改性二氧化硅材料为载体，固定化酶时戊二醛的最佳浓度是 5%，制备得固定化酶活力高达1550U/kg，与0.5%浓度相比，其活力增加35%漆酶量影响固定化效果，酶量一定程度的增加，有利于提高固定化效率，过高的酶量会产生空间位阻，不利于固定化酶催化的反应，使其活力下降。固定化体系中漆酶的最佳浓度为 1.0 mg/m L，所制备得固定化酶活力高达 167 U/mg。此外，固定化时间过长、固定化溶液酸碱性过强对漆酶的活性会产生不良影响，准确的固定化时间、固定化溶液pH 能使固定化酶活性保持率上升。

1.3.4 结合法

结合法主要是通过酶蛋白分子侧链上的活性基团、聚合物载体发生化学反应。这种方法能使漆酶与载体牢固结合，此法具有较强的稳定性和循环使用性，可是其反应条件比较激烈，较容易使酶失活。由于漆酶与载体以共价键相结合，故固定化溶液中酸碱性对酶的固定化效果影响比较大，载体上活性基团不同，固定化漆酶的最佳条件也会有较大的差异。

1.3.5 新型固定化酶方法

固定化酶反应的条件比较温和，酶活力的损失少，而且载体与酶蛋白的相亲结合力也较强，所制得的固定化酶的稳定性高，循环使用性更强。使用金属离子作为固定化中介，将金属离子螯合吸附在微球的表面，用于固定化漆酶，载体和酶蛋白分子间不仅有配位键作用力，还有离子相亲作用力，它反应条件温和，载体和酶蛋白分子间相亲结合力强。这种方法制备得固定化漆酶活性保持率高，稳定性比较好。

1.4 磁性微球的载体

1.4.1 磁性壳聚糖微球载体

壳聚糖分布在甲壳类动物、真菌类细胞壁中，是罕见的碱性多糖，每年产量高达上百亿吨。作为一种天然功能材料，壳聚糖具有生物兼容性、可降解性、生理惰性、抗菌性、无毒、对金属离子螯合性、亲水性和显著的蛋白质亲和性等特点。原材料的丰富性和对活性成分的亲和性，将其应用于固定化酶载体成为了如今研究与开发的重点。壳聚糖由于其不同原料和制备方法，相对分子量范围在几十万至百万之间，可溶于稀盐酸、稀硝酸和大部分有机酸中，而不溶于中性或者碱性溶液中，呈现白色的无定型、略有珍珠光泽粉末状固态。有双螺旋结构，其螺距约为 0.515 nm，一个螺旋平面就有 6个糖残基。壳聚糖就具有二糖结构单元如图 ：

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