摘 要

重组解脂耶氏酵母利用木糖性能的研究

解脂耶氏酵母是一种能利用廉价烷烃类等多种物质为底物的非常规酵母,但解脂耶氏酵母主要以葡萄糖为碳源。木质纤维素作为自然界中最丰富和最廉价的碳源，可将秸秆等农业废弃物转化为生物资源，而木糖作为木质纤维素水解的主要戊糖产物，具有糖含量高、价格低廉等优点。若能使解脂耶氏酵母以木糖为碳源进行代谢活动生产脂质和有机酸，将会极大的降低原料成本，进而提高生产的经济效益。

本论文以季也蒙毕赤酵母中的木糖还原酶（Xyr）、木糖醇脱氢酶（Xdh）、木酮糖激酶（Xyk）为目的基因，将Xyr、Xdh、Xyk三个目的基因构建到113-GPD-TEF质粒上，然后利用醋酸锂转化法将构建完整的线性化质粒导入到感受态细胞中，在尿嘧啶缺陷型培养基中进行筛选，获取重组基因组的解脂耶氏酵母。

得到的重组解脂耶氏酵母最初并不能很好的利用木糖，使其在以木糖为唯一碳源的培养基中适应性进化，以使其能逐渐适应木糖为碳源的生长环境，经过一段时间适应后，重组解脂耶氏酵母能够在木糖为碳源的培养基中进行代谢活动。本实验为进一步对重组解脂耶氏酵母利用木糖代谢的发酵条件进行优化奠定了基础，也为日后开发利用木糖为廉价原料生产相应工业产品提供了理论基础。

关键词：重组 解脂耶氏酵母 木糖 季也蒙毕赤酵母 适应性进化

Abstract

Study on the Utilization of Xylose in Recombinant Yarrowia

Yarrowia lipolytica is an unconventional yeast with a wide range of substrates and the use of organic acids and inexpensive alkanes as substrates. However, Yarrowia lipolytica mainly uses glucose as a carbon source. As the most abundant and cheapest carbon source in nature, lignocellulose can convert agricultural waste such as straw into biological resources, and xylose is the main pentose product of lignocellulosic hydrolysis, which has the advantages of high sugar content and low price. . If Yarrowia lipolytica can be used to carry out metabolic activities of xylose as a carbon source to produce lipids and organic acids, the cost of raw materials will be greatly reduced, thereby increasing the economic benefits of production.

In this paper, xylose reductase (Xyr), xylitol dehydrogenase (Xdh) and xylulose kinase (Xyk) in Pichia pastoris are the target genes, and xylose reductase and xylulokinase are used. The three target genes of xylitol dehydrogenase were constructed on the 113-GPD-TEF plasmid, and then the constructed linearized plasmid was introduced into competent cells by lithium acetate transformation in a uracil-deficient medium. Screening for the recombinant genome of Yarrowia lipolytica.

The obtained recombinant Yarrowia lipolytica could not make good use of xylose at first, so that it can adapt to the growth of xylose as the sole carbon source, so that it can gradually adapt to the growth environment of xylose as a carbon source. After a period of adaptation, the recombinant Yarrowia lipolytica can perform metabolic activities in a medium in which xylose is a carbon source. This experiment lays a foundation for further optimization of the fermentation conditions of recombinant Yarrowia lipolytica using xylose metabolism, and provides a theoretical basis for the future development and utilization of xylose as a cheap raw material for the production of corresponding industrial products.

Key words:Recombinant；Yarrowia lipolytica；xylose,；Pichia pastoris；adaptive evolution

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1解脂耶氏酵母的背景 1

1.1.1解脂耶氏酵母的概要 1

1.1.2解脂耶氏酵母的理论研究 1

1.1.3解脂耶氏酵母的工业应用研究 2

1.2重组解脂耶氏酵母代谢木糖的研究 3

1.2.1重组解脂耶氏酵母利用木糖的代谢途径 3

1.2.2重组解脂耶氏酵母利用木糖研究的瓶颈 4

1.2.3重组解脂耶氏酵母的展望 5

1.3本论文的研究内容及拟采取的手段 5

1.4本论文的研究意义 6

第二章 实验部分 7

2.1 仪器试剂与培养基 7

2.1.1 酵母菌株 7

2.1.2 仪器与设备 7

2.1.3 试剂 8

2.1.4 培养基 8

2.2 目的基因的获取 9

2.3 构建重组解脂耶氏酵母的表达载体 10

2.4重组解脂耶氏酵母 11

2.5重组解脂耶氏酵母的适应性进化 11

2.6重组解脂耶氏酵母的验证 12

第三章 实验结果与讨论 14

3.1目的基因Xyr、Xyk、Xdh的回收 14

3.2 目的基因Xdh、Xyk的菌落PCR验证结果 15

3.3表达载体Xyr-Xyk-113-GPD-TEF的构建结果 15

3.4表达载体Xdh-Xyr-Xyk-113-GPD-TEF的构建结果 16

3.5重组解脂耶氏酵母的验证结果 17

3.6重组解脂耶氏酵母中目的基因及18s rDNA的验证结果 18

3.7重组解脂耶氏酵母适应性进化结果 18

3.8重组解脂耶氏酵母驯化后与原始菌利用木糖的对比 19

第四章 总结 21

参考文献 22

第一章 文献综述

1.1 解脂耶氏酵母

1.1.1 解脂耶氏酵母的概要

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是一种属于半子囊菌类的非常规酵母。该酵母分布广泛，具有较强的抗逆性，能够耐受过高酸碱等极端环境，又因其有较强的分解疏水性化合物的能力，常可在海边、采油井口等环境中分离得到。但它只能以葡萄糖、甘油、醋酸盐为碳源进行生长，不能利用更为廉价，来源广泛的碳源。

解脂耶氏酵母与传统的酿酒酵母相比有许多独特的理化性质、代谢特点和基因结构。首先，解脂耶氏酵母中的蛋白质主要通过共转录途径分泌；其次，它具有高分泌能力和低糖基化修饰；最后它被美国食品药品监督管理局( Food and Drug Administration，FDA) 认定为非致病微生物，可安全应用于食品和药品工业的生产上。Madzak在2004年提出了将解脂耶氏酵母用于异源蛋白的生产，目前解脂耶氏酵母的基因组序列可在NCBI网站上获得。

随着系统生物学技术的发展，已经提出了解脂耶氏酵母的基因组规模代谢网络模型和转录组分析，并鉴定了参与脂质代谢的功能基因。此外，解脂耶氏酵母已被用作线粒体复合物、RNA剪接和基因组进化的研究模型，其也被认为是全细胞生物催化剂，且已应用于生物传感器和精细化学等方面，解脂耶氏酵母作为一个很有前途的细胞工厂，引起了研究人员的广泛兴趣。

1.1.2 解脂耶氏酵母的理论研究

研究人员主要在基因组的选择性剪切和脂质的合成等方面展开解脂耶氏酵母的基础理论研究。由于解脂耶氏酵母同其他酵母菌相比，其基因组中存在大量的内含子结构，这就为剪切其基因组、选择性插入外源目的基因提供了条件，进而提高其基因编码效率，使其能够表达出更多不同种类的蛋白质。因此，解脂耶氏酵母可以作为较好的选择性剪切模板。比如在酿酒酵母中基因MDH2和MDH3分别编码细胞质和过氧化物酶体中的苹果酸脱氢酶，而通过内含子可变的3端剪切，可使解脂耶氏酵母基因Y1MDH2分别编码MDH2和MDH3所表达的苹果酸脱氢酶，这个例子很好的证明了对解脂耶氏酵母进行选择性剪切能够提高其基因表达效率。

解脂耶氏酵母作为生产脂质的常用生物技术底盘，脂质是生产燃料和化学品的首选原料。使用木质纤维素水解产物作为低成本的碳源，可以很好地降低微生物脂质生产的成本。研究人员通过过量表达解脂耶氏酵母天然的Xyr、Xyk、Xdh基因，可使其在木糖为唯一碳源的培养基上生长。将相同的策略转移到经过修饰以过量产生脂质的菌株，可以有效的将木糖转化为油，并且，该菌株仍然能够响应不同的C/N比，在低氮培养基中也能适当生长。选择生长最优的菌株，在使用廉价的木质纤维素水解产物作为独特碳源的补料分批生物反应器控制条件下生长，发酵条件实现了非常高的脂质产率和生产率。这项工作很大地降低了与脂质衍生化合物生产相关的成本。

1.1.3 解脂耶氏酵母的工业应用研究

经研究人员的大量研究发现，解脂耶氏酵母在污染物的处理上可以发挥很大的作用。解脂耶氏酵母因其有很强的分解疏水性化合物的能力，可以将其应用到某些污染物的处理上，比如该酵母对化工炸药产生的污染就有很好的降解作用，通过降解化工炸药中硝基芳香族化合物来消除其对土壤及地表水的污染。另一方面，解脂耶氏酵母可以吸附环境中的钴、镍等重金属离子，分解农药中的有机磷成分，从而在一定程度上可以解除这些污染物对土壤和水质的污染。

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