摘 要

对称二苯乙烯及其衍生物具有特征的紫外-可见吸收和荧光性能，因此它们在光物理和光化学领域有广泛的应用。本论文设计合成了含有对称二苯乙烯结构的苯乙烯基苯丙氨酸，此非天然氨基酸具备特殊的紫外-可见吸收和荧光性能，分子中双键的顺-反异构化过程也具有重要的研究价值，可以用作荧光探针。具体的合成路线是以苯乙烯与4-碘-L-苯丙氨酸为原料，通过Heck反应来完成苯乙烯基苯丙氨酸。我们还用类似的方法合成了几种苯乙烯基苯丙氨酸的衍生物，并分析了在苯乙烯上引入取代基对这些荧光非天然氨基酸荧光性能的影响。

关键词：荧光探针；二苯乙烯；苯丙氨酸；Heck反应

Abstract

Symmetrical diphenylethene and its derivatives have special UV-Vis absorption and fluorescence. Therefore, they are widely used in photophysical and photochemical fields. In this paper, the styryl phenylalanine containing symmetrical Symmetrical diphenylethene was designed and synthesized. This non-natural amino acid has special UV-Vis absorption and fluorescence properties. The cis-trans isomerization process of double bonds in the molecule also has important research value. Thus it can serve as fluorescent probe. The synthetic route starts with styrene and 4-iodine-L- phenylalanine, and uses Heck reaction to synthesize the target compound. Several derivatives of it were synthesized in a similar way, and the effects of the introduction of substituents to styrene on the fluorescence properties of these non-natural amino acids were analyzed. This article describes the synthesis of styrylphenylalanine fluorescent probes using styrene and its derivatives and 4-iodo-L-phenylalanine as raw materials and comparing the addition of substituents to styrene. Effects on the fluorescence properties of fluorescent probes.

Key Words：Fluorescent probe; stilbene; phenylalanine; Heck reaction

目录

第1章、绪论 1

1.1 背景 1

第2章、简介 1

2.1荧光原理 1

2.2选材原因 3

2.3研究现状 4

2.3.1二苯乙烯类化合物研究现状 4

2.3.3二苯乙烯类化合物合成研究进展 5

2.3.4 Heck反应研究现状 6

第3章、实验 8

3.1实验路线 8

3.2合成与提纯 10

1的合成： 10

2的合成： 11

3的合成： 11

4的合成： 12

5的合成： 12

6的合成： 12

7、8的合成： 13

9的合成： 13

10、11的合成： 14

3.3反应优化 14

3.4药品与仪器 15

第4章、仪器分析 18

4.1 产物核磁图谱 18

4.2 氨基酸的基本光谱性质 22

5、结果与讨论 25

5.1实验结果 25

5.2实验讨论 26

5.3展望 27

参考文献 28

致谢 29

第1章、绪论

1.1 背景

蛋白质作为生命活动的主要承担者，历来都受到科研工作者的重视。但是不同于小分子物质，蛋白质的相对分子量大，结构复杂，种类繁多，研究起来困难很大。这对蛋白质的分析方法提出了更高的要求，具有方便，快捷，准确性高，特异性强，高通量等优点的方法成为科研者的需求，并成为分析科学的重点学科^[1]。氨基酸作为蛋白质的组成成分，在研究蛋白质等领域起到重要的作用。经过很长一段时间的探索，人们发现人体内的氨基酸只有20种，各种氨基酸都有其用处,不同的氨基酸按照基因编码以特定的顺序组成大分子蛋白质表现出不同的生物活性。为了方便检测，在研究中多用非天然氨基酸即氨基酸的衍生物^[2]。

实际上，生物体内物质的检测是比较有难度的，各种物质有其特定的作用，但是大部分都很庞大而复杂。而荧光标记法正是这样一种具有多种优势的研究方法，用来标记荧光的具有荧光特性的工具称为荧光探针。现已被使用的荧光探针种类繁多，标记方式也多种多样，但是用在蛋白质这种有活性的生物大分子上，需要考虑到探针对蛋白质活性以及结构的影响。在蛋白质的最小分子单元—氨基酸上面来入手可能会对蛋白质的生物活性影响较少。

第2章、简介

2.1荧光原理

荧光是一种光致发光的冷发光现象，一般情况下其发光原理是处于基态的原子受到适当波长的光照后，原子周围的电子接受能量由低能级向高能级跃迁，但是高能级状态的电子是不稳定的，因此会恢复到基态，同时会以发光的方式释放出能量。由于跃迁过程中能量有所消耗，发射的荧光会比照射光的波长长，能量低。原理图见图1-1。

图1-1 荧光产生原理A1,A2：吸收；F：荧光；ic：内转化；P：磷光；isc：系间串跃；vr：振动弛豫

在光致发光中，电子自旋状态不会被改变，因此荧光不会引起物质性质的变化，但是荧光会受到环境等因素的影响^[3]。

荧光物质可以用于制作探针，荧光探针的概念比较广泛，当一个分子能在某一物质或者体系的物理性质发生变化时自身的荧光信号发生相应的改变，就可以称该分子为某物质或者体系的荧光探针^[4]。

有荧光特性的物质有很多类，但是能发出荧光的有机物种类还是比较少，许多物质吸收照射光的能量后同样发生电子跃迁后还原，但是能量并不是通过辐射衰变转化为光能发射出，而是通过非辐射衰变转化为热能。

要使分子产生荧光有两个前提，一是分子要能够通过辐射衰变发出光能，这样才能吸收激发光；二是分子需要具有较高的荧光量子产率^[5]。

荧光探针对分子的荧光性能有较大的要求，首先是需要斯托克斯位移比较大以抵抗背景干扰，其次还要荧光量子产率高，才能方便检测。分子的荧光发射波长总是大于其激发光波长，斯托克斯位移就是荧光光谱与其对应的吸收光谱相比发生了红移时，对应的两点之间波长差。以激发峰值处波长减去发射峰值处波长得到的波长差来表示，斯托克斯位移越大则表示物质受激发达到激发态再回到基态之间所消耗的能量越多，同时抗背景干扰能力也更强。产生斯托克斯位移的产生原因有很多，内转换和振动弛豫等，激发态分子与溶剂分子相互作用时也会增大斯托克斯位移，因此在测量比较的时候需要统一溶剂。

2.2选材原因

蛋白质中含有芳香族的氨基酸在特定波长照射后会有荧光产生，这类荧光称为内源性荧光^[6]。而苯丙氨酸就是结构比较简单的一种含芳香族的氨基酸，许多科学家用各种荧光染色剂最为指示剂来研究该类蛋白质的结构，但此类染料缺陷较大。显然从蛋白质基本组成成分氨基酸上下手，对其进行简单的修饰，增强其荧光性能，再将其结合到蛋白质中对蛋白质结构以及活性的影响较小。

分子荧光能力的影响因素有很多，结构影响和环境影响等。分子自身的结构是影响其自身荧光性能的主要因素，共轭效应对荧光有增强效果、结构的平面与刚性可以增强荧光、分子跃迁方式、不同取代基会造成荧光增强或荧光淬灭。

从荧光效果的结构影响来看，二苯乙烯首先因为高度共轭且有两个大π键，跃迁类型主要是π^* π，荧光效率较高；其次二苯乙烯有较高的共轭程度，电子离域性高，在各类跃迁中π^* π跃迁已被证实是最利于荧光发射的跃迁方式，容易被激发也容易产生荧光；最后二苯乙烯共轭系统的刚性平面也同样有利于增强分子的荧光性能^[7]。因此确定以二苯乙烯类荧光探针为本次毕设的研究方向。相关研究有崔景强^[8]设计了二苯乙烯类荧光探针，并成功进行测试。

因为终止码抑制技术的出现，人们已经可以将非天然氨基酸定向定点地嵌入任何的功能蛋白质中^[9]。利用具有特殊光学的非天然氨基酸的嵌入，研究者可以利用光谱学手段，来对蛋白质的结构以及内部活性进行检测^[10]。Cohen研究组合成的A ladan开启了蛋白质嵌入研究的新篇章，但是A ladan由于含萘，刚性较大，因此在许多方面有所缺陷，比如会影响目标蛋白的活性^[11]。池振国^[12]等在研究叔丁基苯咔唑衍生物发光材料时的实验设计给了本实验很大的启发。

因此本实验以最简单的苯乙烯，与最简单的含苯氨基酸——苯丙氨酸的结合，组成二苯乙烯类氨基酸衍生物为研究方向，主要探讨其合成方法。根据分子结构中的取代基效应对荧光性能的影响，在苯乙烯的对位上取代其他基团，来纵向探讨不同取代基对苯乙烯基苯丙氨酸的荧光性能的改变。

2.3研究现状

2.3.1二苯乙烯类化合物研究现状

二苯乙烯类化合物最为人所熟知的是二苯乙烯苷作为十大仙草中何首乌的药理成分，其药理作用为二苯乙烯苷对CYP1A2、 CYP2C9 mRNA的表达影响^[13]。还有三甲氧基二苯乙烯在胃癌的治疗上表现出的优良作用，抑制胃癌癌细胞的繁殖同时还能增强化疗的效果^[14]。研究人员也做过二苯乙烯苷对小鼠的影响，发现二苯乙烯苷对痴呆小鼠的学习记忆能力具有有利影响^[15]。二苯乙烯类化合物的荧光性能也是如今越来越受人关注的点，以其在生物体的积极作用，被研究做荧光探针具有广阔的应用前景。

二苯乙烯的光学性质是现在二苯乙烯研究的热点，二苯乙烯两个苯环之间为双键连接，两个苯环的平面结构不能旋转，因此有顺反异构。双键两侧分别含有一个氢，以及一个苯环，当氢在双键同一侧时称为顺式，不同一侧时称为反式。

顺-二苯乙烯 反-二苯乙烯

反式的构型在热力学上比较稳定，并且有共轭双键，其吸收光谱在近紫外光范围内。普通的反式二苯乙烯在受到进紫外光照射后，进入激发态，但是双键的高速扭转使得95%的激发态分子在跃迁回基态的时候是以顺反的异构化来释放能量，只有很小一部分的分子才能以荧光的方式释放能量。因此虽然反式二苯乙烯比顺式光学性能强，但是没有其他取代基的反式二苯乙烯荧光性能一般。而对于激发态的顺式二苯乙烯更是主要以热能的方式衰变，荧光性能更差^[16]。

二苯乙烯的荧光性能被大量应用的还有荧光增白剂，因为其具有荧光量子产率高，化学稳定性高，抗增白效果及光抑制性好、水溶性好等优点^[17]。

在大量对二苯乙烯类化合物应用于荧光增白剂的研究下，对二苯乙烯的荧光量子产率进行增强的方法已经越来越多。主要的方法是通过在苯环上添加各类基团，不同基团由于其不同的电子效应，对分子的荧光会造成不同影响。一般来说给电子基团会使分子的荧光增强，而吸电子基团对荧光有负面影响可能造成荧光淬灭。

2.3.2蛋白质荧光探针研究进展

随着生命科学的研究深入，对细胞的研究更加细化，作为生命活动承担着的蛋白质自然也成为研究的重点。荧光标记法因为其优异的效果而受到大家欢迎。蛋白质的荧光探针主要的作用方式是用荧光小分子与蛋白质进行结合，黄志平^[18]等，对多肽型荧光探针在蛋白质检测中的应用进行了研究，并且分别测定了单荧光标记的多肽型荧光探针，及双荧光标记的效果。但是具有特异性的多肽难以寻找，并且标记后的蛋白质不能在生命系统中发挥作用，对蛋白质的进一步研究还需要寻找新的荧光探针。

新的荧光探针研究方向将会侧重一下几点：

(1)、寻找新的荧光探针,要求其对蛋白质的亲和性能更强,对所处微观环境变化的灵敏度更高,还要做到不影响蛋白质的天然结构,要求被标记后的蛋白质具有生理活性，并且能够承担其原本的生理活动，以方便实时实地的检测；

(2)、可以标记在生命活动中承担重要催化作用的生酶类,实现对酶的催化过程进行监测分析,研究酶活性部位在生物体内的催化机理；

(3)、荧光标记酶探针利用酶与底物的专一性实现对酶底物的检测 ,且随着人工模拟酶的发展,荧光染料将来可能应用于模拟酶的标记，同样能够检测底物^[19]。

2.3.3二苯乙烯类化合物合成研究进展

二苯乙烯类化合物是指含有两个苯环且苯环之间由一个双键连接的化合物， 两个苯环与双键组成了高度共轭的系统。而苯环与双键连接就涉及到了异构现象，二苯乙烯的合成研究主要在双键的构成与专一的获得所需要的构型上。由于其在生物研究方面体现出的大量优异性能，对于不同种类的二苯乙烯类化合物的反应研究受到大量研究人员的重视，已经发展为一个庞大而详细的合成网络。

二苯乙烯化合物一般以苯乙烯为原料合成，根据其反应的催化剂种类可以分为金属参与的反应和无金属参与的反应。

Perkin反应

无金属参与

Wittig，Wittig-horner反应

Julia反应

Knoevenagel反应

Heck反应

Kumada偶联反应

有金属参与

McMurry偶联反应

Grignard反应

在上述各类反应方法中，Wittig反应、Perkin反应以及Heck反应被应用的最多。三者各有优缺点，Wittig反应有较高的条件要求，一般是在手套箱中进行无水无氧操作，反应操作难度高，同时副反应较多，副产物复杂导致产品难以纯化；Perkin反应温和原料廉价，但是分离难度更高，因为易生成大量的与产物性质相似的副产物，如羧基的顺式构型；Heck反应为烯烃或者炔烃与苯环上的卤带位发生反应，对官能团选择性不高，同时又具有较高的立体选择性，因此颇受欢迎，但是其缺点是作为有金属参与的反应，催化剂钯价格昂贵^[20]。针对于此，很多人着手研究廉价的催化剂替换物，以及工业化时的催化剂回收再利用。

Heck反应立体选择性高，适用范围广，而且两种底料苯乙烯与卤代苯丙氨酸正好符合本实验要求，因此本实验初步制定二苯乙烯类苯丙氨酸的合成方式以Heck 反应来进行C-C偶联。

2.3.4 Heck反应研究现状

Heck反应是C-C偶联反应，其反应对象一般为乙烯基化合物与卤代芳香化合物等。Heck反应底物复杂，可供改进研究的方向多，其中催化剂钯和配体是研究的热点。催化剂与配体在Heck反应中具有重要辅助作用，机理见图2-1。

在整个反应中催化剂钯一直可以循环利用，因此虽然催化剂价格昂贵，但是用量较少，并且可以通过设计来实现重复利用，可改进的空间很大。而配体（图中以三苯基膦为代表）则在催化剂的整个作用过程中都有重要作用。目前工业化的Heck反应以三苯基膦为主要配体，因为其已经实现了大规模生产，较为廉价。但是Heck反应产率不高是其最需要改进的地方，在反应过程中起重要作用的配体自然也有很大的优化空间。

图2-1 Heck反应机理

完整的较为经典的Heck反应实验报导有Guiso等^[21]于2002年使用完整系统的Heck反应得到白藜芦醇，如图2-2。

从该反应流程中可以看出，反应2是生成双键，4为合成二苯乙烯，1与3则是对酚羟基的保护，5为脱保护，芳基基团的保护也是Heck反应在不同二苯乙烯类化合物合成中最主要的区别，在该反应中，被保护的是酚羟基，苯环上的基团改变保护的方法也需要进行适应性的改变，C-C偶联反应中加入的底物也会有所不同。保护基团的选择也需要谨慎，不仅需要能起到保护作用，并且不影响偶联反应，还要在反应后容易脱去，不会影响产物的性质。如Mu^[22]在使用苄基作为保护基得到全保护的二苯乙烯类产物后，在脱掉保护基的时候发现双键被还原。

Heck反应作为第一个使用钯催化的C-C偶联反应，研究应用较多。近年来，对于Heck反应改进的报导也有很多，如更换配体使用二茂铁膦，可以免除保护过程，简化实验步骤，提高总收率。对配体的选择以及用量也有过研究报导，孙楠^[23]等在对水相中的Heck反应研究中，发现配体在体系中对钯催化剂起稳定作用，因此配体的加入量与催化剂的用量相关，过多或过少都会造成产率下降对反应不利。

图2-2白藜芦醇合成路线

第3章、实验

3.1实验路线

根据参考文献，实验室的仪器种类，以及实验室已备药品，确定了以下基本路线。

化合物1,2的合成是4-碘-L-苯丙氨酸氨基与羧基的保护，二碳酸二叔丁酯是一种新型的氨基保护剂，尤其适用于氨基酸上氨基的保护。羧基的保护则可以使用较为成熟简单的酯化法，Dion van der Born等^[24]报导了4-碘-L-苯丙氨酸的保护过程及相关研究。

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