摘 要 本文利用大肠杆菌表达得到了重组型PrP全长蛋白纤维，利用固体核磁共振的方法采集NCA，DARR二维实验以及NCACX,NCOCX,CONCA三维实验，利用主链行走得到其残基化学位移，并分析其结构特点。通过分析其纤维蛋白的结构，对比可溶性单体的PrP^c蛋白结构，试图找到其折叠的原理，探索错误折叠机制，为解释生理状态下PrP^c错误折叠成PrP^Sc的相关生物物理过程提供参考。 论文主要研究了PrP蛋白的折叠结构并用固体核磁共振方法采集核磁信号，研究其结构特点。 研究结果表明：重组PrP全长纤维C-末端的二级结构主要为β折叠。 本文的特色：本文利用了大肠杆菌得到的重组型PrP全长纤维蛋白结构较为均一，分辨率较好。利用固体核磁技术采集蛋白纤维的核磁谱图，并对其结构特征进行分析。 关键词:淀粉样蛋白 朊蛋白 固体核磁 Abstract In this paper, we use the recombinant PrP full-length protein fiber was expressed by Escherichia coli, then use solid nuclear magnetic resonance to collect NCA, DARR two-dimensional experiments and NCACX,NCOCX,CONCA three-dimensional experiments, after that use the main chain walking to obtain the residual chemical shift and analyze its structural characteristics .Through the analysis of the structure of the fibrous protein, in contrast to the soluble monomer of PrP^c protein structure, we are trying to find the principle of the fold, to explore the mechanism of protein misfolding and to explain the physiological state of PrP^c misfolding into PrP^Sc relevant biophysical process to provide the reference. The paper mainly studies the folding structure of PrP protein and uses solid NMR method to collect the nuclear magnetic signal and study its structural characteristics. The results show that the secondary structure of the C terminal of the PrP full-length is mainly about the foldβ. The characteristics of this paper: this paper uses the recombinant PrP full-length fiber protein structure obtained by Escherichia coli which is homogeneous and has a good resolution. Solid nuclear magnetic resonance signal was used to collect the signal and to study its characteristic. Key words: amyloid protein，prion，solid-state NMR 目 录 第1章 绪论 1 第2章 固体核磁 4 2.1 固体核磁共振基础 4 2.2 同位素标记策略 5 2.3 实验设计 6 2.4 样品设计 6 第3章 PrP蛋白 8 3.1 PrP蛋白 8 3.2 固体核磁在淀粉样纤维蛋白结构解析中的应用 10 第4章 实验 17 4.1 固体核磁实验序列介绍 17 4.2 PrP23-230蛋白 21 4.2.1 样品制备 21 4.2.2 样品表征 21 4.3 数据处理 24 第5章 结论 27 参考文献 29 致谢 32 第1章 绪论 蛋白质在人体内的异常积累被认为是很多疾病的基础^[1,2]，这些疾病包括传染性海绵状脑病 (朊病毒疾病克雅氏(CJD)，牛海绵状脑病（BSE）等），II型糖尿病，阿尔茨海默病（AD）和帕金森病等。 “淀粉样蛋白”的传统定义为患者体内衍生出的细胞外原纤维，是一种球蛋白和粘多糖复合物，因与碘反应会产生类似淀粉的反应而得名，多用于具有交叉β-片层结构特征的多肽组装体^[3]，可被刚果红染料染色而观察到。 淀粉样蛋白疾病是由淀粉样蛋白的聚集沉积造成的。缺乏针对性和有效治疗方法不仅严重威胁患者的生命，折磨着患者及其亲属，也给社会造成了一定负担，因此开发有效的药物迫在眉睫。但尽管人们积极研究淀粉样纤维的分子结构，仍缺乏对聚集体形成的机制的理解和它们如何引起疾病相关的细胞毒性研究，这阻碍了对致病性蛋白质错误折叠和聚集的设计治疗。如图1.1所示为几种淀粉样蛋白斑块图。 淀粉样蛋白疾病的一个共同特点：球状可溶的蛋白质转变为不溶的聚集原纤维形式^[1,2]。有证据表明，对细胞有毒的物质是早期可溶性聚集体，而不是原纤维^[1]，但是所涉及的蛋白质也能形成纤维状聚集体。无论产生前体蛋白的氨基酸序列和三维结构是怎样的，成熟淀粉状蛋白原纤维都具有一般特征：（1）通过电子显微镜（EM）或原子力显微镜（AFM）技术观察到，淀粉状蛋白原纤维普遍是直径7-13 nm左右的线状结构，长度约为几微米。纤维一般包含2-8根原丝，每根直径约2-7 nm，彼此捻合或横向缔合成宽2-7 nm，长至30 nm的束，但也能观察到不捻合的单丝原纤维^[5,6]。（2）X射线衍射研究证明蛋白结构存在交叉β模式^[7]，其中β链之间的氢键距离为4.7-4.8 Å，且β链垂直于原纤维轴，单体彼此堆叠形成延伸的β片。这种结构也得到了傅里叶变换红外光谱，固态核磁共振（ssNMR）^[5,8,9]的验证。（3）β片结构可以结合染料如硫黄素-T（ThT）、刚果红（CR）及其衍生物，这些染料沿着原纤维形成有序阵列，具有特定光谱响应^[10]。纤维状形态，交叉β结构和特征着色性质这三个特征普遍认为是淀粉样蛋白结构的标志。 传染性海绵状脑病（Transmissible spongiform encephalopathy,TSE）是淀粉样蛋白疾病的一种，是一组致命的中枢神经系统由朊病毒引起的常见人类和动物来源的退行性疾病，又称朊病毒病^[2]。在人和动物间主要存在的疾病包括羊瘙痒病、牛海绵状脑病和人的克-雅氏病、格-斯氏综合征、库鲁病等。关于其传染性病原体被广泛接受的是“纯蛋白”假说。该假说指出感染因子由正常细胞蛋白的修饰形式组成，即正常蛋白PrP^c可以通过某种自催化过程转化为错误折叠的病理形式PrP^Sc，这两种蛋白氨基酸序列相同，主要的差异在于空间构象上的区别^[2,4,9]。   A为β-淀粉样蛋白（amyloid-β）斑块图；B为胰岛淀粉样蛋白（amylin）斑块图；C为朊蛋白（prion）斑块图；D为突触核蛋白（α-synuclein斑块图^[4]）。 本文利用大肠杆菌表达得到重组型的PrP全长纤维样品，通过优化制备条件得到样品，样品结构较均一，分辨率较好。再利用固体核磁共振技术研究其结构特点，利用主链归属等方法得到氨基酸主链和侧链化学位移等信息，在完成化学位移归属情况下，利用结构分析软件得到其二级结构，为解释朊病毒的错误折叠机理提供参考。