论文总字数：19017字

摘 要

菊粉是一种大部分存在于菊苣，菊芋等植物中的天然果聚糖。菊粉酶，主要来自于菊科植物组织和部分微生物，同时能够水解果聚糖中β－2，l－D一果聚糖果糖苷键的一类水解酶。菊粉酶依据其水解果糖苷键的方式不同，将其分为内切和外切两类。内切菊粉酶只对菊粉作用，它随机断开菊粉链内部的糖苷键，其水解产物主要为菊粉型的低聚糖。故可通过菊粉酶的催化作用，以菊粉为原料，用以生产高果糖浆、低聚果糖、乙醇等产品。

本文以研究毕赤酵母表达内切菊粉酶的酶学性质为目的，对其最适反应PH，最适反应温度，热稳定性，酸碱稳定性,储存稳定性等酶学性质进行测定研究，对内切菊粉酶的制备和产业化及其在低聚果糖制备上的应用上，提供了最佳实验条件参考。

本实验对在毕赤酵母表达的内切菊粉酶的酶学性质进行了研究，用来确定其达到最大酶活时的实验条件。酶活测定采用DNS法(二硝基水杨酸法)，通过测定样品在540nm波长下的吸光度，在果糖标准曲线查出其对应果糖量，从而计算确定其酶活力。研究表明此内切菊粉酶的最适反应温度为60℃左右，在低于40℃的条件下具有良好的热稳定性，当温度高于60℃时，酶的热稳定差。内切菊粉酶的最适反应pH为4.6左右，在pH4.0-5.5时酸碱稳定性较好。储藏1-2周时具有较好的稳定性，时间长于3周时，其储藏稳定性越来越差。

关键词：毕赤酵母 内切菊粉酶 酶学性质

Characteristics of Endoinulinse from Pichia pastoris

Abstract

Inulin is a natural fructopolysaccharide which was found in composite plants such as Jerusalem artichoke ,radicchio，etc.Inulinase , a kind of hydrolytic enzyme which leaves the -2,1-linkage of inulin for preparation of fructo-oligosaccharides and fructose ,was found plant tissue and some microorganism in composite plants.Different ways hydrolyzing glycosidic bonds separate endoinulinase from exoinulinase.Endoinulinase only acts on inulin by cutting glycosidic bonds of the links inside the inulin ,ans hydrolysis product is inulin-type oligosaccaride.So we can make the inulin as raw material by inulinase catalyzing produce high fructose syrup ,fructo-oligosaccharide and ethanol etc.

In this paper ,chariacteristics of endolinulinase from Pichia pastoris were studied,which were quantified about the best reaction pH,the best reaction temperature,thermal stability,acid-base stability and storage stability,etc.The preparation and industrialization of indoinulinase and fructo-oligosaccharide can reference the best experimental condition.

This experiment has a research on the chariacteristics of endolinlinase to make sure of the experimental condition when it reaches the max activity. Mensurating the activity by using DNS method(3,5dinitrosalicylic acid colorimetry).To measure the absorbance under 540nm wavelength,then get the fructose content standard curve in the standard curve ,and it can get the activity.In the study,the best reaction temperature of the endoinulinase is 60℃，and it has a good thermal stability when it is 30-60℃,besides it gets poor thermal stability when it is over 60℃.The best reaction pH is 4.6,and it has an acid-base stability when it is pH4.0-5.5.When it is storaged 1-2 weeks,the stability is good,however,the stability becomes worse when it’s stored over 3 weeks.

Key words:Pichia pastoris；endolinulinase；chariacteristics

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 引言 1

1.1 前言 1

1.2内切菊粉酶概述 1

1.2.1内切菊粉酶 1

1.2.2 内切菊粉酶来源 2

1.2.3 内切菊粉酶制备低聚果糖 2

1.3毕赤酵母表达系统概述 2

1.3.1基因工程发展技术 2

1.3.2 毕赤酵母表达系统 3

1.3.3毕赤酵母与其他系统相比的优点 3

1.3.4外源蛋白在毕赤酵母中的表达过程 4

1.3.5毕赤酵母的应用与展望 4

1.4.酶学性质的概述 4

1.4.1酶的最适温度及热稳定性 4

1.4.2 酶的最适PH及酸碱稳定性 5

1.4.3 酶的储存稳定性 5

1.4.4酶的其他酶学性质 5

1.5 3,5二硝基水杨酸测还原糖法（DNS法） 5

1.6菊粉酶的酶活测定 6

1.6.1酶活概述 6

1.6.2酶活的测定方法 6

1.7本课题的研究内容与意义 7

第二章 内切菊粉酶的酶学性质研究 8

2.1材料 8

2.2试剂配制 9

2.3 测试方法 10

2.4内切菊粉酶活测定方法 10

2.5酶学性质测定 11

2.5.1最适反应温度的测定 11

2.5.2 热稳定性分析 11

2.5.3最适反应pH 12

2.5.4酸碱稳定性 12

2.5.5储存稳定性 12

第三章 结果与分析 13

3.1最适反应温度 13

3.2热稳定性 14

3.3内切菊粉酶的最适反应pH 14

3.4内切菊粉酶的酸碱稳定性 15

3.5储藏稳定性 16

3.6小结 16

第四章 总结与思考 17

致谢 20

第一章 引言

1.1 前言

如今，环境日益恶劣，全球资源渐显贫乏，而菊芋作为一种能够抗寒、抗盐碱，抗病虫害，耐旱的农作物，从上个世纪九十年代起，日益得到了全世界各国研究工作者的关注^[26-27]。同时，随着社会的进步和养生生活意识的提高，人们愈加关注自身的身体健康。菊粉作为一种功能性果聚糖，也是最易溶解的水溶性膳食纤维，它所具备的众多生理功效：降低血脂，改善肠道环境，促进益生菌增长繁殖，防治便秘，促进矿物质吸收，预防肥胖症的发生，平衡血糖水平等，使其拥有很大的需求和很好的市场。

菊芋主要储存碳水化合物的部位为根茎，菊粉含量近80%。菊粉存在于上万种植物之中，此外，从微生物中也可以获取菊粉。商品用的菊粉主要来源于天然植物，我国目前用于菊粉生产的植物主要是菊芋。但是我国菊芋深加工处于较低水平，主要以生产酱菜为主，附加值低，因此开发菊芋资源高值利用技术，对于在加快我国农产品加工的科技进步，农村经济发展方式多样化、增加民众经济收入等方面具有重要意义^[28]。

菊粉又名菊糖，为D-呋喃果糖通过β-2 , 1糖苷键连接的天然多聚果糖。菊粉的还原端连接着一个葡萄糖基，结构为直链，聚合度是2-60，3000-5000的分子量，其分子大小由植物类型、气候状况及收获季节而决定^[1]。于菊芋、菊苣和牛蒡等植物的根部或茎部可以获得它。

菊粉酶为一类水解酶，它能够水解β－2，l－D一果聚糖果糖苷键，学名又叫β－2，l－D一果聚糖酶。主要来源于菊科植物的组织和部分微生物。依据其来源不同，特性也不相同，来自植物的菊粉酶，其底物专一性较强，仅对菊粉作用;大部分都能水解含有β- 2, 1呋喃果糖的糖通常由微生物产生，如菊糖、蔗糖和棉子糖，只有小部分对菊糖进行水解。

1.2内切菊粉酶概述

1.2.1内切菊粉酶

内切菊粉酶仅对菊粉作用，通过对菊粉链内部的糖苷键随机断裂，水解产生菊粉型的低聚三糖、四糖和五糖^[2]。在菊粉酶的催化作用下，以菊粉为原料，反应生产出高果糖浆、低聚果糖、乙醇和琥珀酸等产品。

1.2.2 内切菊粉酶来源

研究表明，丝状真菌^[3-4]和酵母^[5]都能产生内切菊粉酶.Onodera小组于1996年，首次将其青霉中克隆到内切菊粉酶基因INUA，之后各研究小组分别又从无花果曲霉^[3]、黑曲霉^[4]和季也蒙毕赤酵母^[5]等多种微生物克隆到了内切菊粉酶基因。内切菊粉酶生产制备的技术依靠飞速发展基因工程技术和现代分子生物技术将发展迅速。

1.2.3 内切菊粉酶制备低聚果糖

由2-10个果糖或葡萄糖通过糖苷键结合而成的低聚合度糖类是低聚果糖，为一种功能性低聚糖。近些年来，具有高效选择人或动物体内双歧杆菌的增殖作用和增强机体免疫力等独特的生理功能功能性的功能性低聚糖，在食品和饲料添加剂领域中成为研究的热点。在实验中，水解菊粉产物以F3、F4、F5、F6为主，32%的水解率，为Penicillium purpurogenum内切菊粉酶^[6]。 Penicillium sp. TN-88内切菊粉酶水解菊粉因其反应时间不同，其产物也不同，24 h前产物以F2、F3、F4为主，拥有50%的水解率; 72 h时产物以三糖为主^[7]，水解率为70％ 。

1.3毕赤酵母表达系统概述

1.3.1基因工程发展技术

生物体生产外源蛋白依靠基因工程技术的发展，拥有广阔的前景。生物研究技术到目前为止，已发展了很多种蛋白质表达系统，例如，高等真核细胞表达系统，大肠埃希氏菌表达系统，酵母表达系统等。很久以来，作为宿主，用大肠埃希氏菌表达了多种蛋白。因其遗传背景和生化特性清楚，易操作，生长迅速和对营养要求简单等，从而被广泛应用，但这一系统本身也存在不少缺陷:

1.真核生物的蛋白翻译后，缺少修饰和加工，如剪切、糖基化及二硫键的形成等;

2.蛋白被表达时，其中很多形成不溶性包含体，若需恢复构象和活性，必须经过复杂的复性;

3.背景蛋白很多，纯化复杂;

4.表达量一般不是很高。

酵母表达系统自1979年开始发展，其最初是为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点。酿酒酵母由于繁殖速度快，能进行高密度发酵，且可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工，被研究人员最先使用。Hitzeman等于1981年用酿酒酵母表达人干扰素并且获得成功^[8]，此后多种其他原核和真核蛋白也通过该系统表达，同时酿酒酵母系统也具有缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不稳定等局限性。由此，新一代的酵母表达系统—巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统应运而生，即甲醇酵母表达系统。

1.3.2 毕赤酵母表达系统

从20世纪80年代年开发以来，作为一种甲醇利用型酵母菌，经过对其研究，至今毕赤酵母已有多个种属被研究出来，主要包括两个种属，Candida和P idz is，共有30余种，其中以毕赤酵母发展尤其迅速。

作为目前应用最广，表达最好的外源基因表达系统之一，巴斯德毕赤酵母表达系统不仅克服了多种缺陷，包括结构复杂的蛋白质而大肠杆菌表达系统不能表达、在表达时，蛋白很多形成不溶性包涵体、较多的背景蛋白、较低的表达产量等，满足了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的缺陷。迄今已有300多种外源蛋白在该表达系统中被成功表达^[9]，最高的已报导的表达量分别为22g/L(胞内)^[10]和14.8g/L(分泌) ^[11]。

1.3.3毕赤酵母与其他系统相比的优点

将毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌表达系统相比，见下表1-1：

表1-1毕赤酵母与其他表达系统的比较

由表1-1所示，蛋白翻译后，大肠杆菌缺少修饰和加工，如剪切糖基化形成二硫键等，并且一般表达量不是很高^[19]；酿酒酵母产物量不高，不适合高密度发酵；而毕赤酵母拥有的优点，如自身分泌的的背景蛋白少，极低的糖基化程度，易于高密度发酵^[20]。

1.3.4外源蛋白在毕赤酵母中的表达过程

异源蛋白在酵母中表达包含四个步骤:

1.将编码异源蛋白的DNA 序列于有酵母启动子和转录终止序列的表达框中克隆。

2.转化及在宿主中稳定维持此DNA融合产物。

3.异源蛋白在特定培养条件下合成。

4.异源蛋白的纯化及其与天然产物的比较^[12]

1.3.5毕赤酵母的应用与展望

从20世纪80年代初到现在，应用范围越来越广泛的毕赤酵母表达系统，已将500多种蛋白^[13]成功表达。同时，

1.除了已表达多种外源蛋白，毕赤酵母表达系统还表达了包括来自植物、动物和细菌的各种酶、膜受体蛋白、含辅基的蛋白质，还有可以用于研究晶体结构的蛋白质^[14]等。其可以将全细胞作为生物催化剂^[15]时，同时表达酶组分比例适当的一个酶系。

2.作为一种有用的模型系统，毕赤酵母用于现代细胞生物学的基础研究主要包括输入和组装过氧化物酶体、过氧化物酶体选择性自噬降解的分子机制和真核细胞分泌途径的结构与功能等研究。

1.4.酶学性质的概述

1.4.1酶的最适温度及热稳定性

1.温度对酶促反应的速度的影响包括:一是随着温度升高，酶反应速度加快;二是随着温度升高，酶逐渐变性失活。酶反应的过程中存在一个最适温度，当以前一种作用为主，温度是低于最适温度的，以后一种作用为主时，温度高于最适温度。张国青等^[16]在毛壳霉内切菊粉酶的性质研究中，在反应系统中，于35一60℃分别测定酶液酶活力。结果显示，其最适作用温度为50 ~ 55 ℃。在不同温度(20 ~ 60 ℃)下将酶液在保温30min，然后测定毛壳酶内切菊粉酶的残留酶活力。结果表明此菊粉酶稳定区间在50℃以下，高于50 ℃时酶活性急剧下降，而当温度为60℃时，酶活性完全丧失。

2.通常对酶的热稳定性测定常通过在一定温度范围内对酶液进行保温，不断升温，进而测定残留酶活力，得出残存酶活随温度的不断升高而变化的趋势，得出某个温度区间变化趋势相对平稳。从而确定，酶的热稳定性区间。

1.4.2 酶的最适PH及酸碱稳定性

1.梁海晶^[17]在对 AtzB最适反应pH值的测定中于40 ℃条件下，分别考察酶促反应在pH值为5.0, 6.0,7.0, 8.0, 9.0, 10.0的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄ （0.05mo1.L^-1)缓冲溶液下AtzB的活性，上述各pH处理中，最大酶活力设为100%，比较得出其余pH处理中AtzB的相对酶活力，从而确定AtzB的最适pH值。

2.通常对酶的酸碱稳定性的测定通过配制不同PH值的底物，加入适量稀释的酶液，于一定温度下在一定时间范围内测酶活。从而确定，酶的酸碱稳定性。

1.4.3 酶的储存稳定性

酶的储存稳定性一般指随着时间的推移，酶抵抗各种外界及自身条件的影响，保持其酶活力始终稳定的能力。特定的空间结构决定了酶的生物活性。对于扩大对酶的使用范围和条件而言，酶的储存稳定性研究具有重大的实用应用价值。

1.4.4酶的其他酶学性质

酶的其他酶学性质还包括一些金属离子对酶的影响，如在对木聚糖酶酶学性质的研究中^[18]，Na , Ca^2十、Cu² 在较低浓度时，对木聚糖酶活性有激活作用，而在较高浓度下，开始出现抑制，其中Cu² 的抑制作用最为突出;Mg² ,Zn² 在1 mM及5mM时均表现为不同程度的激活作用;因Fe³ , Mn² 的存在，木聚糖酶有抑制酶活作用，而Fe³ 拥有最强的抑制作用。

酶的其他酶学性质还包括酶的底物抑制类型，反应机制，动力学等等。

1.5 3,5二硝基水杨酸测还原糖法（DNS法）

糖定量测定的基本方法为还原糖的测定。还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类，单糖都是还原糖，而双糖和多糖不一定是还原糖。

在碱性条件下，还原糖被加热氧化成糖酸和其他产物，3,5二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量越多，棕红色物质的颜色越深，呈正比关系，在540nm波长下使用分光光度计，测定其OD值，参照标准曲线并计算出样品中还原糖的含量。

本文由于内切菊粉酶仅对菊粉作用，菊粉链内部的糖苷键被随机断开，菊粉型的低聚果糖是其主要产物，故采用3,5二硝基水杨酸法测内切菊粉酶水解所产的果糖含量。

1.6菊粉酶的酶活测定

1.6.1酶活概述

在一定条件下，酶活力可以用酶催化某一化学反应的速度来表示。酶催化反应速度越大，酶活力越高，酶催化反应速度越小，酶活力越低。测定酶活力实际上就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度通常是表示为单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。

菊粉酶活力的定义国内外并没有统一，在国内通常定义为，在一定条件下每分钟产生1μmol还原糖所需酶量为一个菊粉酶活力单位（μmol•min^-1mL^-1）。所说的一定条件就是指在测定酶活力之前，对粗酶液进行的前处理。

1.6.2酶活的测定方法

目前尚未统一菊粉酶活力测定方法及酶活力单位定义，国内一般定义为在一定条件下每分钟产生1μmol还原糖所需酶量为一个菊粉酶活力单位（μmol•min^-1mL^-1）。国内研究者对菊粉酶的酶活测定做出了很多研究。

黎明兰等（1995）做培养基使用菊芋提取液。发酵后，将0.5mL发酵液加4.5mL5%菊粉液，用磷酸-柠檬酸盐缓冲液（pH在3-5间酶活高）进行稀释，55℃反应30min，沸水浴煮10min灭活终止反应，在同样条件下于相同的反应系统加入沸水浴煮10min的酶作为对照。用斐林试剂对一定量反应液采用热滴定法测糖。

Uhm（1987）的方式是于50μL适当稀释的酶液中加入450μL、5%的菊粉（0.1mol、pH4.5的醋酸缓冲液配制），60℃水浴保温10min，沸水浴煮5min，终止灭活（在完全相同的条件下和相同的反应系统加入沸水浴煮10min的酶作为灭活酶底物对照），迅速冷却后，Derycke等（1984）测定还原糖用Somogi—Nelson法。与Uhm（1987）不同，陈晓明等（2000）测定酶活时采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖数量。下表1-2为不同的菊粉酶活力测定方法^[25]。本文也将采用陈晓明（2000）测定酶活的方法。

表1-2 菊粉酶活力测定结果

1.7本课题的研究内容与意义

菊粉可以被水解成果糖和低聚果糖。菊粉是一种天然营养甜味剂，因其甜度高，热量低，从而可以成为优质的甜味剂和低热值食品原料，越来越受到消费者和生产商的青睐。

在自然界中，能够分泌菊粉酶的微生物分布很广，来源于水，土壤，动物消化道中的很多种多种微生物都能分泌菊粉酶。由菊粉酶生产的高果糖浆，具有多种其他糖类无法比拟的优点，其价廉，香甜，清爽，储藏条件要求低，不易导致龋齿，同时糖尿病患者可使用其作为糖类替代品，所以全球很多发达国家于食品和医药工业广泛应用。如今菊粉酶制果糖的技术被广泛研究应用，其工艺，转化率和果糖产量变得越来越高，研究显示可以通过菊粉酶直接生产超高果葡糖浆，果糖拥有90%以上的含量。由此可见，在果糖及果葡糖浆的生产上，菊粉酶拥有无与伦比的应用发展潜能。

本文对内切菊粉酶的最适PH，最适温度，热稳定性，酸碱稳定性,储存稳定性等酶学性质进行定量测定，对于内切菊粉酶的制备和产业化，提供最佳的实验条件参考，具有深刻的意义。

第二章 内切菊粉酶的酶学性质研究

内切型菊粉酶通常分离自真菌,比如粗褶金孢子菌(Chrysosporium pannorum) 、无花果曲霉( Aspergillus ficuum )等。它仅对菊粉作用，从菊粉分子内部随机切断糖苷键,水解产生低聚果糖和少量的果糖。本章节主要研究毕赤酵母产内切菊粉酶的酶学性质，包括最适反应温度，最适反应pH，热稳定性，酸碱稳定性，储存稳定性等。

2.1材料

2.1.1.菌种

毕赤酵母（Pichia pastoris），菊粉酶生产菌株，由南京工业大学生物与制药学院实验室提供。

2.1.2.原料

菊粉，由青海特种糖业有限公司提供，纯度为90%。

请支付后下载全文，论文总字数：19017字