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摘 要

植酸酶(E.C.3.1.3.8，肌醇六磷酸盐磷酸水解酶)具有特殊的空间结构，能够依次分离植酸分子中的磷，将植酸（盐）降解为肌醇和无机磷，同时释放出与植酸（盐）结合的其它营养物质。磷是动物体内必需的一种矿物质，对体内正常的新陈代谢中有着重要的作用。经过大量研究表明，在猪、禽等的日粮中添加植酸酶，可使饲料中磷的利用率提高60%，粪便中磷的排出量减少40%，这样就可以减少饲料中磷的添加量，在提高畜牧生产效益及降低环境污染方面起着重要意义。

本论文研究了高溶氧生化反应器在植酸酶高密度发酵中的应用。对其操作特性，尤其是气液分散转子的转速对发酵的影响进行了研究。结果表明，无论是溶氧量、菌体生长状况还是植酸酶的表达量均随着转速的提高而增加。另外，还对比了高溶氧生化反应器用于植酸酶的高密度发酵与普通机械搅拌反应器用于植酸酶的高密度发酵的试验结果，结果表明，高溶氧生化反应器比普通机械搅拌反应器有显著的性能提升。在相同发酵条件下，高溶氧生化反应器所产的菌体浓度明显要比机械搅拌反应器所产的菌体浓度要高。且在高溶氧生化反应器中，当菌体浓度达到180 g/L时，1300 rpm 下的高溶氧反应器与1500 rpm下的高溶氧反应器中的发酵液中的溶氧分别依然能够维持在30%和50%以上，而在普通机械搅拌反应器中，菌体浓度达到180 g/L时，发酵液中的溶氧只有5%左右。另外高溶氧生化反应器所产的植酸酶的表达量与普通机械搅拌反应器所产的植酸酶的表达量相比有显著提高，且能够至少缩短24 h的发酵时间。因此，高溶氧生化反应器能够用于基因工程菌重组外源蛋白的高密度发酵工艺，且能够从根本上解决溶解氧的限制问题。同时，还研究了超滤膜浓缩用于制备液体植酸酶的研究。结果表明，超滤膜分离技术对发酵植酸酶的浓缩效率较高，平均在93% 以上。最适操作温度和操作压力分别为10 ℃和0.3 MPa。

关键词：基因工程 高密度发酵 溶解氧（DO） 酶制剂 高溶氧生化反应器

A study for the fermentation process of genetic engineering phytase

Abstract

Phytase (EC3.1.3.8, phytate-phosphate hydrolase) has a special spatial structure can be sequentially separating phytic acid molecule of phosphorus, the phytic acid (salt) degraded to inositol and inorganic phosphorus, while the release of Other nutrients and phytic acid (salt) binding. Phosphorus is a mineral animals necessary for normal body metabolism plays an important role. After a lot of research shows that phytase in pig and poultry diets, phosphorus can feed efficiency by 60%, reduce fecal phosphorus excretion of 40%, so that you can reduce the phosphorus in feed added volume, play important role in improving livestock production efficiency and reduce environmental pollution.

 This paper studied the application of high dissolved oxygen biochemical reactor in phytase high density fermentation. Its operating characteristics, in particular gas-liquid dispersion rotor speed on fermentation was investigated. The results showed that both the amount of dissolved oxygen, yeast growth conditions or phytase expression levels were increased with increasing speed. In addition, comparison of test results of the high dissolved oxygen bioreactor for phytase high density fermentation and ordinary mechanical stirring reactor for phytase high density fermentation, which showed that high dissolved oxygen bioreactor has a significant performance improvement than ordinary mechanical stirring reactor. In the case of the rotor speed at 1300 rpm and 1500 rpm. At the same fermentation conditions, cell concentrations of high dissolved oxygen bioreactor produced significantly better than cell concentration of mechanically agitated reactor produced. And when the cell concentration at 180 g/L, the fermentation broth is still able to maintain dissolved oxygen above 30% and 50% respectively. But in the general machinery stirring reactor, when the cell concentration at 180 g/L, the dissolved oxygen is only about 5%.Otherwise, there has been a significant increase in the phytase expression by high dissolved oxygen bioreactor produced than the phytase expression by ordinary mechanically stirred reactor produced. The fermentation time can be shortened at least 24 h. Therefore, high dissolved oxygen bioreactor can be used in genetic engineering bacteria restructuring foreign proteins of high density fermentation, and be able to solve the problem of dissolved oxygen limitation fundamentally. We also studied the ultrafiltration membrane concentration was used to prepare liquid phytase. The results showed that the ultrafiltration membrane separation technology of phytase fermentation enrichment has high efficiency, concentrate yield above 93% on average.

And the optimum operating temperature and pressure at 10 ℃ and 0.3 MPa respectively.

KEYWORDS: Genetic engineering；High density fermentation；Dissolved oxygen（DO）；Enzyme preparations；High dissolved oxygen bioreactor

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 植酸酶性质及研究状况 1

1.2 高密度发酵的简介 1

1.3 高溶氧反应器用于工程菌酶生产的概述 2

1.3.1 溶解氧简述 2

1.3.2 生物发酵过程中氧的传递与控制 3

1.3.3 工程菌酶发酵过程中的溶氧控制研究现状 4

1.3.4 高溶氧反应器的概述 5

第二章 实验与结果讨论 7

2.1 主要仪器和试剂 7

2.1.1主要实验仪器 7

2.1.2 主要实验试剂 7

2.1.3 培养基配方 8

2.1.4 植酸酶酶活测定试剂的配制 9

2.2 实验方法 9

2.2.1 实验菌种 9

2.2.2 发酵罐发酵方法 9

2.2.3 超滤膜浓缩制备液体剂型植酸酶的方法 10

2.2.4 结果分析方法 12

2.3 结果与讨论 13

2.3.1 无机磷标准曲线测定 13

2.3.2 气液分散转子转速对高溶氧生化反应器用于高密度发酵的影响 14

2.3.3 高溶氧反应器与普通机械搅拌反应器的发酵性能对比 15

2.3.4 超滤膜浓缩制备液体剂型植酸酶的试验结果 17

第三章 结论与展望 20

3.1 结论 20

3.2 展望 20

参考文献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 植酸酶性质及研究状况

植酸酶能水解植酸和一些有机磷化合物，是一类特殊的酸性磷酸酶，属于磷酸单酯水解酶。植酸酶的来源很广泛，包括动物、植物和微生物，其中以微生物来源最为广泛，但自然界微生物中植酸酶的含量很低，远远低于工业生产需求。

国内外对植酸酶的研究已有30多年的历史，但由于天然来源的植酸酶提取困难、分泌量太低、成本太高，难以满足生产的需要。作为饲料用酶使用时，植酸酶加工必须经过一个高温制粒过程，一般的植酸酶活性在此高温下大幅度地不可逆丧失；另外，植酸酶作用在动物胃肠道，而动物胃肠道的温度一般是37 ℃，pH为2.5～7.0，所以商品化植酸酶需要尽量能这两种条件下具有良好的活性 ^[2,3]。由此，构建基因工程菌，获得高效表达植酸酶的菌株，成为解决这些问题的有效途径^[4,5]。通过基因工程等方法不仅可降低生产和应用成本，提高植酸酶的产量，并且还可优化植酸酶某些理化性质，使其具有良好的热稳定性、蛋白酶耐受性、广谱pH耐受性等^[6]。

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