论文总字数：16934字

摘 要

木聚糖是自然界第二大丰富的多聚糖，来源十分广泛，但由于其复杂的结构，导致其降解困难，往往需要多种酶的协同作用。β-1,4-内切木聚糖酶能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，在木聚糖的降解过程中起到关键作用。在已报道的木聚糖酶中，不同微生物来源的木聚糖酶具有不同的理化特性，分子量主要分布于20-40 kDa，最适pH为2-11。木聚糖酶具有广阔的工业应用前景，但由于其酶活低、成本昂贵、酶的稳定性差等原因，大大限制了木聚糖酶在工业上的应用。

Planomicrobium glaciei CHR43是来自极端环境的木聚糖酶产生菌株，我们通过基因库的查找发现了其中的一个编码木聚糖酶的基因，命名为XynB，它与其它基因具有较低的同源性。我们由此推断，它所编码的酶是一类新型嗜热木聚糖酶。

我们成功合成质粒pETDuet-1-XynB并导入大肠杆菌中成功表达，进一步对木聚糖酶 XynB分离、纯化并测定其酶学特性。结果显示，XynB在大肠杆菌内具有极高表达效率，并具有良好的热稳定性和木聚糖酶活性。经纯化后，纯化倍数为2.5，经镍柱纯化后，纯化效率仅为75%。酶学性质表征显示，XynB的最适 pH 是9.0，最适宜反应温度是 80℃，并且有较好的热稳性。

关键词： 木聚糖酶 木聚糖 酶学性质

Cloning and expression of xylanase XynB

Abstract

Xylan is the second most abundant polysaccharide fiber in nature. Because of its complex structure, the completely degradation of xylan needs the cooperation of many kinds of hydrolases. Endo-1, 4-β-xylanase can hydrolyze internal β-1, 4-bonds of xylan, catalyzing it into xylooligosaccharides and D-xylose, and therefore, is one of the most important enzyme for the degradation of xylan.

The multi-strain origins of xylanase contribute to distinct physical and chemical properties. Their molecular weight range most commonly from 20 to 40 kDa. The optimal pH varies between 2.0 and 11.0. Based on structures and characterizations of Xylanases’catalytic regions, they can be divided into different families. Though a wide range of potential applications in varied industries, Xylanase introdution encountered several offsetting conditions such as low enzyme activity, dissapointing pH/thermal stability and prohibitive cost. These drawbacks directly amounted to limited adoptation of Xylanase in daily industrial process.

Here, we found a xylanase in Planomicrobium glaciei CHR43, a psychrophilic strain from an extreme environment. It may serve as a potential xylanase gene which shared low homogeneity. We deduced XynB-coded xylanases may have excellent thermostability.

In this present study, xylanase gene XynB was expressed in Escherichia coli, and the purification and characterization of recombinant XynB were investigated. The results showed that the XynB gene could be expressed highly in the recombinant strain Escherichia coli accompanied with excellent thermostability and xylanase activity. The XynB was purified about 2.5-fold in specific activity with a recovery yield of 75% with Ni-NTA column . XynB showed an optimum activity at 80℃ and pH 9.0.

Keywords:Xylanase; Xylan; Enzymatic properties

目录

摘要 I

Abstract II

第 一 章 文 献 综 述 1

1.1前言 1

1.2木聚糖 1

1.3木聚糖酶 1

1.3.1木聚糖酶的分类 1

1.3.2木聚糖酶的蛋白结构 2

1.3.3木聚糖酶的催化特性 2

1.3.4 木聚糖酶的应用 3

第二章 工程菌的构建及其酶的表达 6

2.1 实验材料 6

2.1.1 菌种 6

2.1.2 主要试剂 6

2.1.3 主要仪器 6

2.1.4 试剂及培养基的配制 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 嗜热酶工程菌的构建 7

2.2.2 木聚糖酶的纯化 8

2.3 实验结果 8

2.3.1 目的质粒的提取及酶切鉴定 8

2.3.2 木聚糖酶的纯化 9

第三章 木聚糖酶 XynB酶学性质表征 11

3.1 实验材料 11

3.1.1 菌种 11

3.1.2 试剂及培养基的配制 11

3.2 实验方法 11

3.2.1 XynB 的活性分析 11

3.2.2 pH对酶活的影响 11

3.2.3 温度对酶活的影响及热稳定性的测定 12

3.2.4 金属离子对酶活力的影响 12

3.3 实验结果 12

3.3.1 温度对酶催化活力的影响及酶的热稳定性 13

3.3.2 pH 对酶催化活力的影响.....................................................................13

3.3.3 不同温度随时间对酶酶活力稳定性的影响 13

3.3.4 金属离子对酶活力的影响 14

第四章 结论与展望 16

参考文献 17

致谢 18

第 一 章 文 献 综 述

1.1前言

化学工业方方面面都关系着人们衣食住行的各个方面，但是传统化工生产过程中存在着耗能大，环境污染严重等缺点，为了可以应对能源危机和环境污染等问题，寻找绿色高效的催化过程日益受到国际社会的关注。生物催化功效具有高效、专一、温和和环境友好的等众多特点，能很好地弥补化学工业的不足，使用生物催化取代化学催化是一直是学术界的研究热点，也是未来化工界的一大趋势。

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