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摘 要

L-苹果酸是一种有机酸，存在于植物，动物和微生物细胞中，在生物体的代谢过程中有重要作用。产氨短杆菌可以在生长过程中产生L-苹果酸。本次实验是对产氨短杆菌培养基进行优化，并使用紫外诱变的方法筛选出突变高产菌体。之后再尝试分离提取出L-苹果酸。

关键词：产氨短杆菌 L-苹果酸 正交试验法 紫外诱变 分离提取

Optimization of culture medium for producing ammonia Separation and extraction of L- malic acid

Abstrct

L- malic acid is an organic acid, which is found in plants, animals and microorganisms. It plays an important role in the metabolism of living organisms.The production of L- in the growth process can be produced by the production of malic acid. The experiment was conducted to optimize the culture medium for the production of ammonia.The mutant high yield strain was screened by UV mutagenesis.And then try to isolate and extract L- malic acid.

Key word：Ammonia producing bacteria L- malic acid Orthogonal test method UV induced mutation Separation and extraction

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 L-苹果酸简介 1

1.2 L-苹果酸的用途 1

1.3 L-苹果酸的合成方法 2

1.4 培养基的优化 2

1.5 正交试验法 2

1.6 菌体诱变 2

1.7 实验目的 3

第二章 实验内容 4

2.1 产氨短杆菌种子培养基的优化 4

2.1.1 实验材料 4

2.1.2 实验方法 4

2.2 发酵培养基的优化 7

2.2.1 实验材料 7

2.2.2 实验方法 7

2.2.3实验结论 8

2.3 紫外诱变高产菌株 9

2.3.1 实验材料： 9

2.3.2 实验步骤 9

2.3.3 实验方法 9

2.4 分离提取 12

2.4.1 实验目的 12

2.4.2 实验材料 12

2.4.3 实验原理 12

2.4.4 实验步骤 12

第三章 结果与展望 14

参考文献 15

致谢 17

第一章 文献综述

1.1L-苹果酸简介^[1]

L-苹果酸，英文名称为：L-Malic acid。分子式为。一般为白色结晶体或结晶粉末，略带酸味，L-苹果酸的酸味程度大约是柠檬酸的1.2倍，并且具有悠扬绵长的独特风格，因此深受人们的喜爱。L-苹果酸的密度为1.595，易溶于水。在天然果汁中含量较高，可广泛应用于，食品、医药、日用品化工等多种领域。

L-苹果酸最初是由新鲜的果汁或是蔬菜汁中直接提取出来，因为它在苹果汁中的含量最高，由此而得名。从20世纪末开始，有机酸工业开始迅速发展，其中的代表就是柠檬酸，但是由于生产柠檬酸的工厂太多，产量过剩而导致价格暴跌。此时，L-苹果酸作为一种新生的有机酸因其用途广泛而在有机酸产业中占据了一席之地。

1.2L-苹果酸的用途^[1]

医药用途：由于L-苹果酸可以直接被生物体利用，在和复合氨基酸注射液同时使用的情况下可以大幅度提高氨基酸的利用率，非常适用于手术过后的虚弱人群和有肝功能障碍的病人。L-苹果酸可以为人体补充钾元素，可以治疗水肿和维持人体内的水分平衡。对高血压和脂肪积聚也有很好的治疗效果。同时L-苹果酸是治疗肝病的良好药物。

食品工业：L-苹果酸最开始都是由新鲜果蔬汁液中直接提取，因此它的味道和天然果实相差无几，可添加在多种饮料中作为酸味剂，广泛应用于糖果、果酱、果冻的生产中。L-苹果酸添加于食品中具有防腐的作用，可以延长保质期。L-苹果酸的酸味作用时间较长，而柠檬酸的酸味作用时间较短，可以将L-苹果酸与柠檬酸配合使用，不同的配比情况下，几乎可以模拟所有天然果实的味道，并且回味悠长，可以大大提升食品的口感。L苹果酸还可以作为饲料用于鸡、鸭等家禽的养殖，亦可添加于猪等家畜的饲料中，对于家禽家畜的健康生长有很好的帮助作用，还可以用于多种水生生物的养殖，包括鲫鱼，鲤鱼等。

化工工业：L-苹果酸呈酸性，可以用作工业清洗剂，芳香剂，除臭剂。在合成材料中添加L-苹果酸可以提高合成材料的可塑造性及延展性。L-苹果酸添加于油漆中可以延长油漆光亮色泽时间，可以用于生产真正无健康污染的有机油漆。在日用品化工中，L-苹果酸也有很大的作用，可以用于生产牙刷，杯子，毛巾以及其他日用品。

1.3L-苹果酸的合成方法

L-苹果酸的传统合成方法为果蔬中直接提取^[21]。具体方法是将石灰乳加入新鲜的果蔬汁液中，提取L-苹果酸钙沉淀，然后使用硫酸将沉淀溶解，得到L-苹果酸溶液，再将其浓缩即可得到成品^[19]。此种方法成本高，材料稀缺，浪费大，很难进行现代化的大规模工业生产。在人类历史的发展中，通过人们的不断探索，L-苹果酸的生产方法也越来越多，除了直接提取法之外，还有四种比较常用的合成方法：DL-苹果酸拆分法、利用微生物产出富马酸，再将富马酸转化为L-苹果酸、使用微生物发酵糖原料生产L-苹果酸、微生物发酵非糖原料生产L-苹果酸。但是化学合成的方法条件较为苛刻，且技术难度非常高，需要非常专业的人员才能从事该项工作，所以化学合成法一直没有得到广泛应用，仅局限于实验室中的少量应用^[20]。微生物在发酵过程中产生L-苹果酸的产率非常低，而且培养菌体使用的原料很多，价格昂贵，同样很难大规模生产，因此L-苹果酸的产量一直不高。现在我们可以从市场上买到的成品L-苹果酸主要是由酶法生产。

1.4培养基的优化

优化产L-苹果酸菌的培养基对L-苹果酸的生产具有非常巨大的意义，通过优化，我们可以找出什么材料最适合微生物发酵生产L-苹果酸，怎么样的营养原料配比可以最大化的利用原料，从而提升产率，减少生产成本，提高L-苹果酸的产量与质量^[17]。当然，培养条件对L-苹果酸的产量同样有巨大的影响，包括PH值，温度，接菌浓度等。

1.5正交试验法^[15]

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