L-核糖异构酶的克隆表达及应用研究毕业论文
2022-03-24 22:08:28
论文总字数：18938字
摘 要
本课题着重对来自发酵放线纤维菌的L-核糖异构酶（Af-L-RI）的编码基因在大肠杆菌中克隆和表达，并对其酶学性质进行了表征，在一定条件下，Af-L-RI酶的活性越高，其催化L-核酮糖转化L-核糖的效率越高。实验结果表明Af-L-RI的最佳温度在40 °C和pH值为8.0，反应动力学常数kcat值为2.2×104 min-1，Km值为135 mM，其相对应的催化效率kcat Km-1是162 mM-1 s-1。之后我们利用L-核糖异构酶，作用于L-核酮糖来制备L-核糖。最终在100 g/l L-核酮糖为底物的反应条件下，生成了约70 g/l的L-核糖，其转化率为70%。L-核糖是一种新颖的药物中间体，具有很大的医药价值，它可以治疗乙肝、丙肝等疾病。本工作着重对来自发酵放线纤维菌的L-核糖异构酶进行克隆表达、以及酶学性质的表征并探究了其在L-核糖实际生产中的应用，为生物法制备L-核糖奠定了一定的理论基础。
关键词：L-核糖异构酶 L-核糖 L-核酮糖 发酵放线纤维菌
ABSTRACT
This study focused on the cloning and expression of the encoding gene derived from Actinotalea fermentans. This gene was successfully expressed in E. coli BL21(DE3). The recombinant enzyme was purified to homogeneity and was characterized. Under certain conditions, the greater the activity of enzymes, the higher the conversion rate of L-ribulose to L-ribose. Results showed that the optimal temperature and pH were 40 °C and pH 8.0. Kinetic parameters results showed that kcat was determined to be 2.2×104 min-1, Km was 135 mM, while the catalytic efficiency was 162 mM-1 s-1. Then, we used this recombinant enzyme to isomerize L-ribulose into L-ribose. Using 100 g/L L-ribulose as substrate, the conversion rate was 70% (w/w). L-Ribose was an important pharmaceutical intermediate, which was useful for hepatitis B virus, hepatitis C virus etc. This work showed the successful cloning, expression, and identification of Af-L-RI. Moreover, we used this enzyme to biologically convert L-ribulose into L-ribose. This study shed light on the bio-production of L-ribose.
Keywords: L-ribose isomerase; L-ribose; L-ribulose; Actinotalea fermentans
目 录
摘 要 I
ABSTRACT II
第一章 文献综述 1
1.1 引言 1
1.2 稀有单糖简介 1
1.2.1 L-阿拉伯糖简介 1
1.3 L-核糖的生理功能及医药应用 2
1.3.1 生理功能 2
1.3.2 医药应用 2
1.4 L-核糖的制备 3
1.4.1 L-核糖的化学制备法 3
1.4.2 L-核糖的生物制备法 3
1.5 课题研究内容以及手段 4
1.5.1 课题研究内容 4
1.5.2 课题拟采用的研究手段 4
第二章 实验材料与方法 5
2.1 实验材料 5
2.1.1 菌株与质粒 5
2.1.2 实验仪器及试剂 5
2.1.3 培养基，培养条件，基因组提取及质粒提取 6
2.2 实验方法 7
2.2.1 PCR反应 7
2.2.2 目的片段Af-L-RI与载体质粒pET28a连接、转化 7
2.2.3 重组质粒pET28a-Af-L-RI的鉴定 7
2.2.4 重组大肠杆菌的诱导表达 8
2.2.5 比色法测L-核糖异构酶的活力 8
2.2.6 L-RI重组菌培养及诱导条件优化 8
2.2.7 L-核糖异构酶酶学性质的研究 8
2.2.8 L-RI催化L-核酮糖制备L-核糖 9
第三章 结果与讨论 10
3.1 编码L-RI的基因Af-L-RI的鉴定和表征 10
3.2 Af-L-RI基因的异源表达和L-RI的表征 11
3.3 底物特异性研究 11
3.4 Af-L-RI催化L-核酮糖条件的研究 12
3.4.1 温度和pH值对Af-L-RI酶活的影响 12
3.4.2 金属离子对Af-L-RI酶活的影响 13
3.4.3 Af-L-RI酶学动力学参数 14
3.4.4 利用L-核糖异构酶催化L-核酮糖制备L-核糖的工艺研究 15
3.5 本章小结 15
第四章 结论与展望 17
4.1 结论 17
4.2 展望 17
参考文献 19
致 谢 22
第一章 文献综述
1.1 引言
L-核糖异构酶（L-RI）是一种罕见的醛酮糖异构酶，该酶仅存在于少数几种微生物中，能够专一性的催化L-核酮糖生成L-核糖，本课题研究通过克隆表达以及酶学性质鉴定获取的一种高效的L-核糖异构酶，该酶能够完成L-核糖的生物法制备。该技术有望实现L-核糖的产业化生产。
L-核糖是用于合成抗病毒药物的重要物质，但它很难在自然界和生物细胞中被发现。L-核糖对人体内普通细胞几乎没有破坏作用，而且有一定的抗癌症和抗病毒的功能。由于L-核糖的具有很高的利用价值，所以L-核糖的应用面日趋被扩展，与此同时，全世界也在不停提高对L-核糖的需求量[1]。制备L-核糖的方法分为两种：化学制备法和生物制备法。在化学制备法的相比之下，生物制备法更适用于制备L-核糖。本课题涉及的生物制备法是以L-阿拉伯糖作为起始原料，利用L-核糖异构酶催化L-核酮糖制备L-核糖，并对L-核糖的现状展开详细的研究[2]。
1.2 稀有单糖简介
稀有单糖，是一类含量很少并且十分罕见的糖类，它附属于稀有糖[3]。它的定义首次被提出是在2001年的ISRS。随着单糖的出现，稀有单糖的定义也被再次完善。稀有单糖虽然带有甜味，但它可以防止龋齿的生长，对人体的健康起到了不少的帮助[4]。经研究发现，目前的稀有糖大概有30多种，但遗憾的是，其中还有一些糖类未被深入研究及报道[5]。
1.2.1 L-阿拉伯糖简介
L-阿拉伯糖是一种无味，略带甜味的白色的晶体性粉末，它的熔点为84~86 °C，可溶于水和甘油，不溶于有机溶剂，L-阿拉伯糖对于热和酸具有较高的稳定性，因此L-阿拉伯糖可在甲醇和乙醇中得到结晶[6]。L-阿拉伯糖，别名果胶糖、树胶醛糖，它属于戊醛糖。L-阿拉伯糖通常是通过与别的单糖结合生成杂多糖，遍及于自然界中[7]。在一些植物细胞壁的半纤维素和果胶质中，L-阿拉伯糖的含量较高[8]。随后，L-阿拉伯糖被确定为新开发糖类，受到了越来越多的关注，并且成功的在功能糖的领域中树立了一定地位[9]。
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