论文总字数：19713字

摘 要

本研究从山东青岛盐碱地小麦根际筛选出一株高产吲哚乙酸的耐盐促生菌YJ4，依据菌株形态学，生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定，菌株YJ4为Enterobacter cloaca。为有效提高YJ4菌株IAA产量，通过单因量变化，研究碳源、氮源、温度、pH、接种量对菌株生长和产IAA影响，进行发酵条件的优化，最后得出高产IAA的发酵条件。实验表明，牛肉膏添加量为0.4%，硝酸铵添加量为0.1%，温度30℃，pH值为6，接种量为4%时该菌株产IAA量最高（108mg/L），比未优化（91mg/L）高出18.68%。通过盆栽实验验证了Enterobacter cloaca YJ4产IAA发酵液接种IAA可显著地促进油菜生长。以上结果证明，分离得到菌株Enterobacter cloaca YJ4具有作为生物肥料促进油菜生长的潜力。同时为促进作物生长和盐碱地的改良治理提供了一个新的思路。

关键词：耐盐促生菌，筛选鉴定，Enterobacter cloacae，发酵条件

Producing indole Salt Bacteria Identification and optimization of fermentation conditions

Abstract

A high yield of indole acetic acid salt PGPR YJ4 isolated from the wheat rhizosphere in Saline of Shandong province was identified as Enterobacter cloaca on the basis of strain morphology physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis. By a single variation due to explore carbon source, nitrogen source, temperature, pH, inoculum size, impact inoculation of IAA production and the strain growth to carry on the optimization of fermentation condition, finally, and we get the fermentation conditions for high yield and IAA. These experiments showed that beef paste adding amount was 0.4%, the ammonium nitrate content was 0.1%, the temperature was 30℃, pH was 6, inoculated quantity was 4%. When the strain is produced the highest amount of IAA (108 mg/L), than 18.68% higher than that of without optimization (91 mg/L) .A significant increase in the growth of rape was recorded for inoculations under controlled conditions. The above results show that strains has great potential as biological fertilizer promoting growth of rapeseed. At the same time it provides a new train of thought to promote crop growth and improvement of saline-alkali governance

keywords: PGPR; Filter; Enterobacter cloacae; Fermentation Conditions;

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1研究背景 1

1.1.1 土地盐渍化现状及危害 1

1.1.2 盐渍土的改良方法 2

1.1.3 耐盐菌 4

1.1.4 植物根际微生物对植物的促生作用 4

1.1.5 生长素—IAA对植物的影响及应用 5

1.2本课题的研究目的及意义 6

第二章 实验部分 7

2.1 材料与试剂 7

2.1.1 材料 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 仪器 7

2.1.4 培养基 7

2.2实验方法 8

2.2.1 产IAA耐盐菌株的筛选和鉴定 8

2.2.2菌株发酵条件优化 9

2.2.3 IAA发酵液对油菜生长的影响 11

2.3实验结果与分析 11

2.3.1 初筛 11

2.3.2复筛 11

2.3.3菌株YJ4生理生化特性 12

2.3.4菌株YJ4基因鉴定 13

2.3.5 YJ4菌株发酵条件的优化 13

2.3. 6 不同稀释发酵液对油菜生长的影响 18

第三章 结论与展望 19

3.1 结论 19

3.2 展望 19

参考文献 20

致 谢 22

第一章 文献综述

1.1研究背景

1.1.1 土地盐渍化现状及危害

盐碱地是由于土壤中水溶性盐分含量过高，而引起自然要素利用发生障碍的一个结合区域(包括地形地貌，水文，植被，地下水等)，是一个属性独特的生态系统。根据联合国粮农组织(FAO)和教科文组织的最新统计数据显示，全世界受到盐渍化侵害而成为盐碱地的土地大约有9．57亿公顷，其中中国的盐碱地面积大约为1亿公顷，是全世界土地遭受盐渍化侵害影响最大的国家，并且土地盐渍化的面积还在不断上升当中^[1]。我国人口基数庞大，人均耕地占有面积少，人均资源占有量相对不足。出于经济建设的需要，不少地方占用农用耕地来进行住房和工程建筑建设，同时由于环境变暖和部分地区环境恶化，进一步蚕食耕地面积。在2009年2月26日，国土资源部公布了2008年全国土地利用变更调查结果，该结果显示，至2008年12月31日截止全国耕地面积为18.2574亿亩，比2007年减少29万亩，我国耕地面积呈逐年减少的趋势。而我国各类盐渍土总量约为14.87亿亩，治理、改良好盐渍地可以提高我国耕地面积，对我国农业发展将会是一笔巨大的财富。同时对于整个生态环境而言将会大幅度的改善。

盐碱地的危害主要表现对耕地的侵蚀上，通过影响植被生长，降低农作物产量甚至出现绝收的情况；同时使生态环境恶化，并且能腐蚀损坏工程设施^[2]。盐碱地对植物生长存在以下几个方面的危害：(1)植物气孔的关闭与气孔保卫细胞内淀粉的形成有关，如果土壤盐浓度过高，该淀粉的合成将会受到阻碍，从而导致植物细胞不能及时关闭，蒸腾作用持续蒸发植物体内水分，植物丧失大量水分，出现因干旱而枯萎的现象。(2)盐碱地的盐土中含有大量的可溶性盐类，使土壤中溶液的渗透压过大，致使植物根系在植物生长过程中不能从土壤中吸收足够的水分来供给植物生长，更为严重的是，由于土壤中溶液浓度高于植物体内细胞液浓度，植物体内渗透压低于土壤，这会导致水分从根细胞外渗到土壤中，使植物萎蔫甚至死亡。(3)一般来说盐渍化的土壤中含有大量的可溶性钠盐，植物对钠离子的吸收将会对吸收其他离子产生影响，具体表现在对钾、磷和其他营养元素的吸收减少，同时也会抑制磷元素的转移，从而影响植物的正常生长。(4)盐碱地土壤中存在多种过量的离子（Na 、Ca² 、CL^-1等），这些过量的离子对植物的生长发育能够产生直接的毒害作用，比如过量的氯离子使植物叶片出现黄化，由于叶片当中叶绿体减少，植物光合作用也相应的减少，导致植物生长缓慢，叶片提前脱落。(5)当生物处于对自身不利的环境中时会表现出相应的适宜性，以此来保证自身的生长发育。由于盐碱地中盐浓度过高，一些盐生植物通过减小叶片面积，增加叶片厚度。以此减少生长周期和减少蒸腾作用，减少对盐分的吸收，平衡细胞内盐浓度。保证自身正常的生长。(6)破坏土地的土壤结构。钠离子能够代换土壤胶体表面的钙离子，使自身覆盖在土壤表面的胶体上，从而导致土壤中土粒分散。土壤原有的结构遭到破坏，出现土壤板结化，降低了土壤的通透性，同时其含氧量降低，生活在该环境中的微生物的活性降低，导致植物根系区域的微生物大量减少，土壤肥力下降^[3]。(7)水土流失，盐渍化的土地不利于植物生长，一些受盐渍化侵蚀严重的土壤因为没有植物固定，在雷暴雨天气下，土壤会随着雨水流入到江河湖海。从而影响整个生态系统。同时因为没有植物固定，土壤在随着大风的裹挟，成为风沙，影响环境，也给人们的生产生活带来了严重的影响。（8）金属在盐溶液中会形成原电池，以钢材为例，钢实际上是一种合金，其主要成分是碳和铁，在盐溶液中钢与溶液构成了一个原电池，在化学势的作用下，钢材中的铁就会被代换出来，形成铁离子。这样钢材中铁的含量降低，其强度、塑性、结构都会发生变化。现代工程建筑大都是以钢筋混凝土建造，使用的金属属于合金，因此被原电池腐蚀也就越容易。会缩短建筑物的使用年限，对建筑物的安全造成严重损害。土地盐渍化已经严重影响到了人们生活的各个方面。

1.1.2 盐渍土的改良方法

为了治理环境，增加耕地面积，缓解土壤盐渍化的进程，以致完全修复土地盐渍化。人们进行了多项尝试。传统上采用水稻种植、化学改良、水利排灌工程等措施对盐碱地进行改良治理工作。随着人们对盐碱地的深度研究，陆续提出了使用聚丙烯酸脂溶液、咸水灌溉作为土壤脱盐处理的思路。前苏联科学家认为，矿化地下水是引起土壤盐渍化的关键，这些地下水的平均深度为2.5~3m的。完善的灌溉系统能够把地下水控制在临界深度之下，防止土壤盐渍化。冲洗、排水、放淤压盐是水利排灌的基本措施，其目的是为了促进土壤脱盐淡过程，加速水盐交换进程。防止土壤返盐，巩固改良成果^[4]。但是水利排灌工程要求盐碱地周围存在水源，并且水源应该足够多、足够优良，同时和良好的排水系统相结合。由于该工程是灌排结合，因此投资大，维护费用较高，含盐排出水处理困难，易造成土壤次生盐渍化及土壤中一些植物必需的矿质元素如P、Fe、Mg与Zn^[5]的流失。同时灌水洗盐的工作一旦停止，将会导致前期脱盐淡化处理的土壤逐渐返盐，将效果无效化，甚至会使土壤盐碱化程度得程度加重；化学改良根据使用化学剂不同，分为化学剂改良和使用有机肥料改良两个方面。根据盐碱地的成分和受土壤盐渍化侵害程度的不同，选择化学改良剂种类和其施入量也就不同，根据经验和资金来确定使用改良剂时间的长短。由于该改良方法需用大量的水进行冲洗处理，因此化学剂改良适用于水资源丰富的地区。有科学研究表明，经过化学剂改良的盐碱地土壤积水下降了254天，渗水上升313毫米。尽管使用化学剂改良有诸多经济条件的制约，但总的来说效益高于成本。土壤瘠薄、干旱也是盐碱地阻碍植物生长的重要因素，并且盐渍化程度越高，土壤肥力也就越低。使用腐殖酸类肥料等有机肥能够增加土壤肥力，促进植物生长，在盐碱地脱盐淡化方面取得较好的效果。尽管化学改良方法在短时间段内能够取得显著的效果，但成本需求大，单一使用化学改良剂效果不佳，也比较容易造成次生盐渍化。对处于对于水资源匮乏的地区难以进行大规模的应用。包括中国、前苏联在内的国家通过长期研究实践发现，水稻能够在盐碱地中生长，同时对盐碱地也有一定的改良效果。在对东欧及中欧盐碱地研究的基础上，匈牙利专家将化学改良、灌溉冲洗和种植水稻三者有机的结合起来，发展成为一种作用范围广的盐碱地改良方法，该方法有着比较广阔的实际应用基础。然而这种方法对水平排水有着严格的要求，通过选育抗盐作物种类品种、间种、套种、合理轮作等方式种植。然而该方法实际操作起来相当复杂，难度较大。有日本研究者发现，聚丙烯酸脂溶液能够与土壤形成水分保护膜，该保护膜是一层厚度约为0.5厘米的封闭水层。由于保护膜包裹着土壤，因此土壤水分不容易因蒸发而减少。土壤中的盐分减少了向地表的积累量，降低了盐度，因此有利于农作物生长。而伊拉克土壤学家发明了一种与众不同的方法，他们通过向表层土壤中混入沥青的方式，来提高土地温度，进而提高土壤盐类溶解度，最后脱盐淡化处理的效果良好。部分国家在治理和改良盐碱地方面，提出用一定盐度的溶液灌溉土地的方法。尽管这样增加了土壤的盐分，但是随着土壤盐度的增加其湿度也相应增加。有印度报道称，印度科学家将稀释的海水灌溉到种有植物土壤中，结果发现农作物生长良好。随着生物技术的发展，在治理盐碱地方面诞生了一个新兴学科——生物改良或称生物修复。它包含植物修复和微生物修复两个主要方面。盐碱地生物修复以植物修复为主，其具有经济和生态效益高、节省能源和淡水、改良效果持久、可推广应用面积大等诸多优点^[6]。

1.1.3 耐盐菌

耐盐菌是对生存环境中氯化钠溶度有着一定耐性的细菌。这类细菌通常生长在含盐地区，例如：海滨滩涂，盐碱地。有研究者发现，在腌制的食品里面也发现了耐盐菌。根据耐盐菌耐盐程度，耐盐菌可分成两类：中度耐盐菌和极端耐盐菌。通过研究发现耐盐菌具有特殊的生理结构和功能特性，例如耐盐菌结构上有‘紫膜，这种特殊结构能够将光能转化为内能^[7]。

1.1.4 植物根际微生物对植物的促生作用

在植物对盐渍土壤的修复^[8-10]的研究中发现，植物和微生物在生物修复方面有着紧密联系，同时发现大部分促生菌为根基促生菌（PGPR）。根际促生菌是指生存在植物根圈范围中，分离出来的对植物生长有促进或对病原菌有拮抗作用的有益的细菌^[11]。假单胞杆菌属和芽孢杆菌属是PGPR主要菌属；其中荧光假单胞菌在许多植物的根际土壤中占据了很高的比例，可达60%～93%；此外，还包黄杆菌属、固氮菌属、固氮螺菌属、肠杆菌属、欧文氏菌属)、节杆菌属、产碱菌属、沙雷氏菌属、克雷伯氏菌属、黄单胞菌属、和慢生根瘤菌属等^[12-14]。根际微生物有多种植物促生属性：PGPR可以固定大气中的氮元素^[15]；产生嗜铁素，吸收土壤中的铁，与病原菌争夺铁，抑制病原菌的生长^[16]；合成分泌包括吲哚乙酸(IAA)，细胞分裂素在内的植物激素^[17]；溶解矿物质不溶磷^[18]；以及合成可调节植物生长和发育的酶，比如PGPR产生的ACC脱氨酶能够清除乙稀合成前体ACC（氨基环丙烷羧酸），从而阻止植物乙烯的合成，促进植物根系生长，降低植物生长发育过程中乙烯浓度，增加幼苗存活率^[19]。PGPR促进植物生长发育机制还不是完全的清楚，微生物-植物-土壤之间相互作用及其复杂，它们可以通过多种方式影响植物的健康和生产力。但是关于利用PGPR的特性改善胁迫条件下植物的生长发育的相关研究已经被报道^[20-22]。也有些根际微生物能够将无效元素化为有效元素（解磷作用、固氮作用等）供植物生长需要同时也能够调节土壤PH^[23]。也有研究显示，根际微生物通过产生抗生素来抑制植物病原微生物的生长，起到一定的生物防治的作用。其中对植物最为重要的是产IAA，这是植物促生作用最重要的一个方面。

1.1.5 生长素—IAA对植物的影响及应用

IAA中文名为吲哚乙酸（生长素）。生长素的浓度影响其众多的生理作用。总的来说：低浓度的IAA能够促进植株生长，而浓度过高时则会抑制生长，甚至会导致植物死亡。IAA诱导乙烯的形成是其发挥抑制作用的关键^[24]。生长素有两个层次的生理表现。首先细胞水平上，生长素能够促进植株形成层细胞分裂、抑制根细胞生长但是会促进插条发根；促进木质部细胞分化，也能促进愈伤组织的形成和分化。在植物整体结构水平上，无论是萌发的幼苗还是成熟的果实，生长素都起着极为关键的作用。IAA能够使幼苗中胚轴伸长出现可逆性的红光抑制；吲哚乙酸能够促使枝条产生向地性，固定地上生长的植株部分；吲哚乙酸能够横向运输，IAA从植株的向光侧向背光侧转移，导致背光侧的吲哚乙酸浓度高于向光侧；在植株生长的过程中，处于顶端的顶芽会抑制植株侧芽的生长，称之为顶端优势，农业、园艺工作者运用该理论，使农作物和花卉多发枝多开花；IAA能够促使叶片产生赤霉素，从而延缓叶片衰老速度；诱导雌花分化，促进植株开花和单性果实发育；抑制乙烯前体生产，延迟果实成熟^[25]；促进气孔的开放，调节光合作用产物的运输和在植株体内的分布。

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