论文总字数：18851字

摘 要

在机体中，嘌呤代谢过程中会带来大量的尿酸，一旦尿酸含量超出正常范围值时，会呈现高尿酸的症状，从而引发痛风等疾病的出现。目前全世界的高尿酸血症人数逐渐增多，极大威胁人们健康。针对这种现象的出现，新兴的尿酸氧化酶被寄予解决这个问题的希望。它的原理是在嘌呤代谢的一个步骤中，催化产生出尿囊素，因而使得尿酸的含量显著减少。本研究在实验菌株中找到了所需要的尿酸氧化酶基因，将其成功转入在纳豆芽孢杆菌中并得到了该酶的表达，然后比较实验前后发酵的嘌呤含量，检测重组后酶表达的活性。实验提取纳豆芽孢杆菌的基因组，PCR扩增得到1041bp目的基因片段，BamHI和XbaI双酶切后将目的基因片段连接到质粒pht01，令pht01-Uox转入E.coli DH5α中，然后验证转入的质粒是否正确。将重组质粒提取，转入枯草宿主菌WB800N表达，产酶为2.102 U/mL。液体发酵总嘌呤量由原始的96.84 mg/L下降到75.56 mg/L。

关键词：尿酸氧化酶 纳豆芽孢杆菌 克隆 嘌呤

Cloning and expression of uric acid oxidase in Bacillus subtilis

Abstract

Uric acid is the final product of purine metabolism, excessive accumulation of uric acid can cause hyperuricemia. Hyperuricemia in the current increase in the world is a major problem that threatens people's health. Uric acid oxidase can convert uric acid into allantoin, so that purine metabolism continues downwards, is the treatment of uric acid caused by the relevant diseases of the drug value of the enzyme. In this experiment, the uric acid oxidase gene was cloned and transformed into Bacillus natto, and the purine content and uric acid oxidase activity were compared before and after recombination. The 1041bp target gene fragment was amplified by PCR. Then BamHI and XbaI digeste the target fragment and the target gene fragment was ligated to plasmid pht01. The recombinant plasmid was transfected into E.coli DH5α and then subjected to plasmid validation and protein expression activity assay. The correct recombinant plasmid was extracted and transferred into Bacillus subtilis BW800N and verified by fermentation.

Key words: Uric acid oxidase ;Bacillus natto ;Clone ;purine

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 嘌呤的简介 1

1.3 尿酸氧化酶的研究进展 2

1.3.1 尿酸氧化酶的概述 2

1.3.2 尿酸氧化酶的酶学特征 2

1.3.3 尿酸氧化酶的应用 2

1.3.4 尿酸氧化酶的研究进展 3

1.4 纳豆芽孢杆菌的简介 3

1.4.1 纳豆芽孢杆菌及其功能 3

1.4.2 纳豆芽孢杆菌的应用 4

1.5 研究前景及展望 4

1.6 研究内容 4

第二章 实验材料与方法 6

2.1 实验材料与配方 6

2.1.1 实验试剂 6

2.1.2 实验仪器 6

2.1.3 工具酶与分子试剂盒 7

2.1.4 培养基与培养方法 8

2.1.5 菌株与质粒 9

2.2 重组载体的构建 9

2.2.1 目的基因的获取 9

2.2.2 重组质粒的构建 10

2.2.3 蛋白SDS-PAGE电泳 12

2.2.4 枯草芽孢杆菌电转化 13

2.3 实验方法 14

2.3.1 嘌呤含量的测定 14

2.3.2 尿酸氧化酶酶活测定 14

2.3.3 发酵验证 15

第三章 实验结果与讨论 16

3.1 重组前嘌呤含量分析 16

3.1.1 色谱条件的验证结果 16

3.1.2 原始的发酵液中嘌呤的含量 16

3.2 重组质粒的构建 17

3.2.1 目的基因的获取 17

3.2.2 载体和基因的双酶切 17

3.2.3 重组质粒的验证 18

3.2.4 尿酸氧化酶基因的表达 18

3.3 发酵验证嘌呤含量分析 19

第四章 结论与展望 20

参考文献 21

致谢 24

第一章 文献综述

1.1 前言

高尿酸血症及其相关症状正在世界范围内广泛增长。血清尿酸水平的升高是由于来自食物成分的尿酸合成增加和肾脏排泄减少引起^[1]，会带来高尿酸、痛风等类似疾病。尿酸是人类嘌呤代谢的终产物,人体的尿酸有两个来源,由体内合成尿酸(内源性),或从食物中分解而来(外源性) ^[2]。尿酸氧化酶被用于减少尿酸在身体里的累积是因为它可以将其转化为尿囊素。

1.2 嘌呤的简介

嘌呤，其化学结构式为C₅H₄N₄，通常以没有颜色的结晶形式存在。

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