论文总字数：25403字

摘 要

环磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate, cAMP)具有调节物质代谢和生物学功能的作用，它广泛参与机体内的各种生理活动，是生命信息传递的第二信使，不仅能调节生理生化过程，影响细胞代谢，而且在医药、畜牧及养殖中都有重要的应用价值。本文利用基因工程技术在大肠杆菌表达系统中表达了腺苷激酶（AK）、腺苷酸激酶（ADK）、乙酸激酶（ACK）和腺苷酸环化酶（AC）。以腺苷为底物，以乙酰磷酸为磷酸基团的供体的多酶催化ATP合成体系；通过将ATP合成相关的酶系与腺苷酸环化酶偶联，开发一条环磷酸腺苷合成的新工艺。建立了以腺苷为底物经过条件优化，以10mM腺苷为底物，AK酶、ADK酶、ACK酶和AC酶的添加比例为1：1：9：4时，催化生成cAMP 0.215g/L。

关键词：多酶催化、环磷酸腺苷、腺苷

Preliminary Study on Synthesis of Cyclic Adenosine Monophosphate by Multi-enzyme Catalysis

Abstract

Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) plays a role in regulating the metabolism and biological functions of substances. It is widely involved in various physiological activities in the body and is the second messenger of life information transmission. It not only regulates physiological and biochemical processes, but also affects Cell metabolism, but also has important application value in medicine, animal husbandry and aquaculture. In this paper, adenosine kinase (AK), adenylate kinase (ADK), acetate kinase (ACK) and adenylyl cyclase (AC) were expressed in E.coli expression system using genetic engineering techniques. Multi-enzyme catalyzed ATP synthesis system was studied in order to produce cyclic adenosine monophosphate, using adenosine as substrate and acetyl phosphate as phosphate donor. Adenosine was used as a substrate to optimize the conditions. When 10 mM adenosine was used as a substrate and the ratio of AK enzyme, ADK enzyme, ACK enzyme, and AC enzyme was 1:1:9:4, the yields of cAMP was 0.215 g/L.

Keywords: Multi-enzyme catalysis, cyclic adenosine monophosphate, adenosine

目 录

摘要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 环磷腺苷 1

1.1.1环磷腺苷简述 1

1.1.2环磷腺苷合成方法 2

1.2三磷酸腺苷 5

1.2.1三磷酸腺苷简述 5

1.2.2 三磷酸腺苷的合成方法 6

1.3 腺苷酸环化酶 7

1.3.1腺苷酸环化酶简述 7

1.3.2 腺苷酸环化酶的研究进展 7

1.4 多酶偶联体系 9

第二章 材料与方法 10

2.1实验材料 10

2.1.1实验菌株 10

2.1.2实验培养基 10

2.2试剂与仪器 10

2.2.1实验试剂 10

2.2.2 实验仪器 11

2.3实验方法 12

2.3.1菌种活化 12

2.3.2诱导培养 12

2.3.3酶液的制取及纯化 12

2.3.4考马斯亮蓝法法测蛋白含量 13

2.3.5酶活性测定 13

2.3.6酶间比例对合成ATP的影响 14

2.3.7不同浓度的Mg² 对合成ATP的影响 15

2.3.8不同浓度的起始ATP添加量对反应的影响 15

2.3.9构建四酶反应体系 15

第三章 结果与讨论 17

3.1 蛋白含量测定 17

3.2酶活测定结果 18

3.3 酶间比例对反应速度的影响 21

3.4不同浓度的Mg² 对反应速度的影响 23

3.5不同浓度的起始ATP添加量对反应的的影响 24

3.6 构建四酶反应体系 25

第四章 结论与展望 28

4.1结论 28

4.2展望 28

参考文献 29

致 谢 34

第一章 文献综述

1.1 环磷腺苷

1.1.1环磷腺苷简述

环磷腺苷（cAMP）生物活性强。其分子量为329.2。其结构如图1-1所示，cAMP由腺嘌呤、核糖和磷酸根构建，拥有磷酸与核糖环化而成的特征性的3’,5’-环式结构。产品为近白色粉末，无臭，溶于水，几乎不溶于乙醚和乙醇，对酸、碱和热很稳定^[1]。有大量cAMP的衍生物， 其生物活性比原来更强^[3]。

图1-1腺苷结构式

1957年萨瑟兰发现了cAMP^[4]。萨瑟兰提出了第二信使理论，即身体中的所有含氮激素在1965年通过细胞内cAMP发挥作用，并首次将cAMP作为第二信使^[5]。cAMP作为人体内广泛存在的一种具有生理活性的物质，对细胞功能和代谢起着重要的调节作用，有生物学作用^[6-9]。它在物质代谢、神经肌肉功能、细胞膜通透性等方面起着重要作用^[10]。

cAMP在疾病的临床诊断，心血管疾病的治疗和免疫力的提高中发挥着重要作用^[10]。 可治疗心脏疾病、风湿性心悸、胸部按压等症状也可得到改善。联合化疗和急性白血病可提高疗效，也可治疗诱导急性白血病^[12]。

1.1.2环磷腺苷合成方法

cAMP具有广泛的应用，需求量大，许多学者对其生产方法开展了研究。cAMP的生产方法有化学合成法、从天然产品中提取、发酵法以及酶法四种方法。目前世界上产业化生产多采用化学合成。

1.1.2.1化学合成法

自二十世纪五十年代cAMP的发现以来，国内外陆续有关于其合成工艺的文献报道，一些工艺方法也逐渐用于生产，cAMP的化学合成法主要有碱性水解法、活性酯类法、DCC 脱水法和三氯氧磷法四种。

（1） 碱性水解法

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