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摘 要

L-鸟氨酸是一种非蛋白质氨基酸，广泛存在于自然界中，具有解氨毒、治疗多种疾病等功效，因此越来越受到人们的关注。然而L-鸟氨酸在生物体内的含量并不高，因此如何提高L-鸟氨酸的产量已成为目前急需解决的问题之一。

本研究通过将目的基因odhI与ppc分别与质粒pXMJ19连接转入谷氨酸棒杆菌CGMCC 1006中，过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶与α-酮戊二酸脱氢酶复合体抑制蛋白odhI，提高L-谷氨酸的产量，以最终达到提高L-鸟氨酸产量的目的。过表达抑制蛋白odhI可使L-鸟氨酸的平均终浓度提高1.06%，而过表达PEPC可使L-鸟氨酸的平均终浓度达到9.58%。

关键词：L-鸟氨酸 谷氨酸棒杆菌 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 α-酮戊二酸脱氢酶复合体

Effect of Transformation of Metabolic Pathway of Corynebacterium glutamicum Oxaloacetate Node and α-Ketoglutarate Node on Synthesis of L-Ornithine

ABSTRACT

L-ornithine is a kind of non-protein amino acid, which is widely found in nature, has the efficacy of detoxification, treatment of various diseases, and so on. Therefore, it has attracted more and more attention. However, the content of L-ornithine in vivo is not high. Therefore, how to increase the production of L-ornithine has become one of the most urgent problems to be solved.
In this study, the objective genes odhI and ppc were transformed into C. glutamicum, overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase and inhibition of protein odhI, increase L-glutamic acid yield, and ultimately to increase L-ornithine The purpose of the production of amino acids. Overexpression of the inhibitory protein odhI increased the average L-ornithine concentration by 1.06%, while overexpression of PEPC resulted in an average L-ornithine concentration of 9.58%.

Keywords：L-ornithine; Corynebacterium glutamicum; Phosphoenolpyruvate carboxylase; α-ketoglutarate dehydrogenase comple

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 L-鸟氨酸 1

1.1.1 L-鸟氨酸简介 1

1.1.2 L-鸟氨酸的作用 1

1.1.3 L-鸟氨酸生产方法 2

1.1.4 L-鸟氨酸的检测 4

1.2 谷氨酸棒杆菌简介 5

1.3 谷氨酸棒杆菌中L-鸟氨酸合成过程中的相关节点 6

1.4 立题背景与意义 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1 实验材料与方法 8

2.1.1 菌株及质粒 8

2.1.3 实验仪器 10

2.1.4 实验试剂 11

2.1.5 培养基 12

2.1.6 茚三酮反应液的配制 13

2.2 菌株的构建 13

2.2.1 目的基因的获取 13

2.2.2 重组质粒的构建 20

2.2.3 C. glutamicum CGMCC 1006电转化 21

2.2.4 重组菌株的构建 21

2.3 酶活的测定 21

2.3.1 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶酶活检测 21

2.3.2 ODHC酶活测定 23

2.4 氨基酸的检测方法 25

第三章 实验结果 26

3.1 目的基因的获取 26

3.2 基因与质粒双酶切 27

3.3 PCR验证 27

3.4 重组菌株的筛选与酶活测定 28

3.5 氨基酸的检测 29

29

第四章 讨论与展望 30

4.1 讨论 30

4.2 展望 30

参考文献 31

致 谢 35

第一章 文献综述

L-鸟氨酸

1.1.1 L-鸟氨酸简介

鸟氨酸（Ornithine）的最初发现者是杰弗。1877年，杰弗在用安息香酸喂养鸟的过程中，发现其尿液水解液中含有某种氨基酸，他将这种氨基酸命名为鸟氨酸。鸟氨酸有L型与D型两种构型，但只有前者具有生理活性。L-鸟氨酸结构如图1-1所示^[1]。其在α位于γ为各有一个氨基，氨基数目大于羧基数目，因此其为碱性氨基酸。L-鸟氨酸在水、乙醇中的溶解度较大，在乙醚中的溶解度较小。其通常以单盐酸盐的形式作为试剂使用。L-鸟氨酸单盐酸盐的水溶性较大，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂^[2]。

L-鸟氨酸非蛋白质的组成成分，但在某些抗菌性肽中能看见它们的存在。L-鸟氨酸是尿素循环的一部分，与绝大多数陆生脊椎动物体内氨的代谢有关。其还能够脱去羧基生成丁二胺，而丁二胺是许多与生命活动密切相关的多胺的前体^[3]。

图1-1 鸟氨酸结构式

Fig. 1-1 Structure of ornithine

1.1.2 L-鸟氨酸的作用

L-鸟氨酸具有多种生理功能，因此在多个领域均有广泛应用，如食品、医药、化工等。

1.1.2.1 食品行业

L-鸟氨酸脱苦的功能使其可作为食品添加剂，起到改善食品风味的作用^[4]。有研究发现，与L-鸟氨酸盐酸盐相比，L-鸟氨酸柠檬酸盐在提升食品与饮料口感方面具有更好的作用^[5]。在日本，L-鸟氨酸、谷氨酸等已成为十分常见的食品调料，在人们生活中已得到广泛的应用^[6]。此外，L-鸟氨酸与精氨酸具有恢复疲劳的功效，因此常用于功能饮料中^[7]。还有研究发现，L-鸟氨酸对生长激素的分泌具有促进作用，能加速脂肪燃烧。运动后服用一定量的L-鸟氨酸能减少脂肪堆积，增强体力，在减肥保健方面有很大益处。这意味着L-鸟氨酸能作为减肥产品为人们所使用，为人们在该行业的发展方面提供了新的思路^[5]。

1.1.2.2 医药行业

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