论文总字数：21959字

摘 要

甲醇是煤化工产业的主要副产物，中国是世界甲醇大国，产能超过世界的50％，但是国内甲醇的利用率很低造成甲醇产能过剩，为了解决这一问题，我们将甲醇引入到工业能源的方向，利用甲基营养杆菌内的甲醇代谢途径，将其引入用于工业生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌当中，本课题通过采用分子生物学和合成生物学的方法，通过向谷氨酸棒杆菌g66中引入与甲醇代谢相关的甲醇脱氢酶（Mdh2）和一磷酸核酮糖途径中的关键酶（Hps-Phi）,成功构建出了一株可以以甲醇为辅助碳源的重组谷氨酸棒杆菌g66,并通过后期葡萄糖和甲醇共碳源，研究重组型谷氨酸棒杆菌g66的甲醇使用情况和发酵产L-鸟氨酸情况，根据实验发现，重组型谷氨酸棒杆菌g66利用家畜速率为0.078 g / (L∙h)^-1。

关键词：谷氨酸棒杆菌 甲醇代谢体系 L-鸟氨酸

Study on Physiological Mechanism of Synthesizing L-Ornithine from Corynebacterium glutamicum Simultaneously with Glucose and Methanol

ABSTRACT

Methanol is a major by-product of the coal chemical industry. China is the world’s largest methanol producer and its production capacity exceeds 50% of the world's. However, the low utilization rate of domestic methanol causes excessive methanol production capacity. To solve this problem, we introduce methanol into industrial energy. In the direction of the use of the methanol metabolism pathway in methylotrophic bacteria, it was introduced into the corynebacterium glutamicum for the industrial production of amino acids. This project adopts the methods of molecular biology and synthetic biology to pass to Corynebacterium glutamicum g66. Methanol dehydrogenase (Mdh2) related to methanol metabolism and key enzyme (Hps-Phi) in the ribulose monophosphate pathway were introduced to successfully construct a recombinant glutamate bar with methanol as an auxiliary carbon source. Bacillus g66, through the late glucose and methanol co-carbon source, to study the use of recombinant C. glutamicum methanol and the fermentation of L-ornithine production, according to experiments found that recombinant C. glutamicum g66 using livestock The rate is 0.078 g/(L∙h)-1.

KeyWords: Corynebacterium glutamicum; Methanol metabolism system; L-Ornithine

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 甲醇概述 1

1.1.1 甲醇国内外研究 1

1.1.2 甲基营养菌的研究进展 2

1.2 L-鸟氨酸概述 3

1.2.1 L-鸟氨酸的性质 3

1.2.2 L-鸟氨酸的应用前景 4

1.2.3 L-鸟氨酸的制备方法 4

1.3 研究内容 5

第二章 实验材料和方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 实验所需器材 7

2.1.2 菌株、质粒、分子试剂 9

2.2 配置培养基 10

2.2.1 配置LB 10

2.2.2 配置种子液、发酵液和茚三酮反应液 10

2.3 实验方法及步骤 11

2.3.1 大肠杆菌DH5α的活化 11

2.3.2 提取pET-duet质粒 11

2.3.3 mdh2的扩增 12

2.3.4 重组质粒的构建 13

2.3.5 谷氨酸棒杆菌感受态的制备 14

2.3.6 重组谷氨酸棒杆菌的恒温培养 15

2.3.7 重组谷氨酸棒杆菌培养过程中的测定 15

2.3.8 谷氨酸棒杆菌发酵生成的L-鸟氨酸测定 15

3.1 pET-duet质粒的提取 16

3.2 PCR结果图 16

3.3 重组质粒提取和酶切结果 17

3.4 质粒与目的基因连接结果验证 17

3.5 葡萄糖/甲醇双碳源强化谷氨酸棒杆菌合成鸟氨酸的生理状态解析 18

3.6 鸟氨酸的产量 19

第四章 结论与展望 20

参考文献 22

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 甲醇概述

1.1.1 甲醇国内外研究

甲醇的化学式为CH₃OH，它是一种有机化合物，又可以被叫做木醇或者木酒精，是所有有机醇类里面最简单的一元醇^[1]。甲醇的纯品颜色是无色透明的，它可以在水中或者大部分的有机溶剂中溶剂，它很容易挥发也很容易被点燃，带有一点儿酒精的气味^[2]。甲醇可以作为有机合成的原料，更是很多制造业的原料，比如药品、油漆、香水、防冻剂、聚丙烯醇等^[3]。因为甲醇有很大的生物可降解性,所以相比较而言生物处理方法会有更广阔的应用前景。采用生物处理方法，不仅可以节约能源，又能减少环境污染，而且还可以在吸收、转化或者合成污染物的同时生成抗菌素、蛋白质、能源和氨基酸等等^[4]。这种类型的微生物分解，不仅可以减少污染，又能废物利用、变废为宝，产生各种各类的效益^[5]。

从上世纪六十年代以来，科学家们在工业化发展这一方面获得了不少实用性的成就，其中发展得最成熟的一个应用，是由能在含甲基的培养基中生长的微生物发酵来产生了单细胞蛋白。单细胞蛋白有可以被叫做甲醇蛋白，简称是SCP^[6]。培养基的配方里主要的原料有氨、磷酸、甲醇和硫酸等，微生物在这种培养基里面生长消耗甲醇，生成单细胞菌体，最终成为菌体单细胞蛋白^[7]。这种甲醇蛋白营养价值非常高，含有17种氨基酸，甚至还包括了在动物体内没有办法合成的氨基酸^[8]。和其他方法生产的单细胞蛋白相比较，甲醇蛋白有着更快的合成速度、更稳定的质量、更多的资源，而且生产的时候不会被气候条件所影响^[9]。现在，很多动物饲料里面可能会加入甲醇蛋白，用来代替各种含蛋白质的物品，比如大豆、鱼粉或者脱脂奶粉等等。在国外，很多牲畜或家禽的饲料里面都添加了甲醇蛋白，而且科学家们打算把甲醇蛋白作成人们食物中的蛋白质添加剂，它还可能成为调味品的原料^[10]。

请支付后下载全文，论文总字数：21959字