论文总字数：20430字

摘 要

目前水体氮污染问题严重，污水的脱氮处理对于维持水体清洁，恢复氮平衡，保护生态环境具有重要意义。目前已报道的反硝化细菌多为革兰氏阴性菌，而革兰氏阳性菌往往被忽略，其中芽孢杆菌属就是革兰氏阳性菌的代表。本研究从南京、宿迁的农田土壤、河道底泥（岸边）、啤酒厂以及污水处理厂采集样品约30份。分离得50株芽孢杆菌，经过脱氮性能测定，结果有30株菌株具有反硝化能力。将这30株菌株分别命名为ZY1-ZY30。经比较发现菌株ZY8、ZY13、ZY22的脱氮率较高，48 h后，分别达到85.27%，62.69%，68.02%。通过对菌株的形态观察、16S rDNA分子生物学鉴定，并构建的系统进化树的分析，初步鉴定菌株ZY8、ZY13、ZY22分别为Bacillus firmus、Lysinibacillus macroides、Bacillus methylotrophicus。同时对菌株ZY8、ZY13、ZY22进行降解有机物和硝酸盐氮的试验。结果显示到24h时，加入此三株菌的反硝化液体培养基中的COD分别为1720 mg/L、1640 mg/L、1400 mg/L；同时分别只剩下9.7 mg/L、20.7 mg/L、36.0 mg/L的硝酸盐氮。

关键词：反硝化细菌 芽孢杆菌 硝酸盐氮 总氮

Separation and Denitrification Performance of Denitrifying Bacillus in Typical Environment

Abstract

At present, the problem of nitrogen pollution in water bodies is serious. The denitrification treatment of sewage has important significance for maintaining water cleanliness, restoring nitrogen balance and protecting the ecological environment. The denitrifying bacteria reported so far are mostly gram-negative bacteria, and Gram-positive bacteria are often overlooked, among which Bacillus is a representative of Gram-positive bacteria.In this study, about 30 samples were collected from agricultural soil, river sediments (shore), breweries and sewage treatment plants in Nanjing and Suqian. 50 strains of Bacillus were isolated and tested for their denitrification performance.As a result, 30 strains showed a denitrification ability, which were named ZY1-ZY30, respectively. The nitrogen removal rates of ZY8, ZY13 and ZY22 were found to be the highest after 48 h, reaching 85.27%, 62.69% and 68.02%, respectively. Through the morphological observation of strains, 16S rDNA molecular biological identification, and the construction of phylogenetic tree analysis, of the strains ZY8, ZY13, ZY22 were indentified to be Bacillus firmus, Lysinibacillus macrolides and Bacillus methylotrophicus, respectively. At the same time, the strains ZY8, ZY13, and ZY22 were tested for degradation of organic matter and nitrate nitrogen. The results showed that at 24 h, the COD in the denitrifying liquid cultures containing the three strains was 1720 mg/L, 1640 mg/L, and 1400 mg/L, respectively, while only 9.7 mg/L, 20.7 mg/L, and 36.0 mg/L of nitrate nitrogen remained.

Key Words:Denitrifying bacteria; Bacillus; Nitrate Nitrogen; Total nitrogen

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1 水环境中的氮污染 1

1.1.1氮的生物地球化学循环 1

1.1.2氮污染的现状 1

1.1.3氮污染的危害 1

1.1.4 氮污染的治理方法 2

1.2 反硝化细菌研究进展 2

1.2.1反硝化细菌 2

1.2.2 反硝化细菌应用 3

1.3 反硝化酶学 3

1.3.1 硝酸还原酶 3

1.3.2 亚硝酸盐还原酶 3

1.3.3 一氧化氮还原酶 4

1.3.4 一氧化二氮还原酶 4

1.4 反硝化芽孢杆菌脱氮性能研究进展 4

1.4.1 反硝化芽孢杆菌 4

1.4.2 生物来源 5

1.4.3 脱氮性能研究 5

1.5 课题的研究目的、意义与内容 5

1.5.1课题的研究目的 5

1.5.2课题的研究内容 5

第二章 实验材料与方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 菌种来源 7

2.1.2 培养基、培养液及相关试剂 7

2.1.3 实验仪器 8

2.2 实验方法 8

2.2.1 分析方法 8

2.2.2 芽孢杆菌的分离 8

2.2.3 反硝化芽孢杆菌脱氮能力的测定 9

2.2.4 菌种鉴定 9

2.2.5 反硝化芽孢杆菌降解有机物和硝酸盐氮能力 9

第三章 结果与分析 10

3.1 菌种分离及脱氮性能的测定 10

3.1.1 菌种的分离 10

3.1.2 菌株ZY1-ZY30脱氮能力的测定 10

3.1.3 菌株ZY8、ZY13、ZY22形态观察和鉴定 11

3.2 菌株降解有机物和硝酸盐氮能力 14

3.2.1降解有机物能力 14

3.2.2硝酸盐氮降解率 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 19

致 谢 23

第一章 绪论

1.1 水环境中的氮污染

1.1.1氮的生物地球化学循环

氮是一种丰富的元素。事实上，氮气体积（N₂）占大气总体积的78％。尽管N₂占有最高的百分比，但由于维管植物不能将N₂直接结合到有机化合物中，所以土壤中的氮缺乏是植物生长和生产力的常见限制因素^[1]。事实上，植物从土壤中吸收的主要氮形式是硝酸盐（NO₃^-）或铵离子（NH₄ ）。氮在环境和生物体中循环，包括细菌。落叶，动物粪便和死亡的植物或动物通过土壤微生物的氨化过程分解有机氮为土壤提供NH₄ 。另一方面，其他细菌通过在称为硝化的过程中氧化NH₄ 产生NO₃^-而获得能量^[2]。然而，并非所有产生的硝酸盐都被植物吸收。一些细菌将硝酸盐转化为亚硝酸盐，然后转化成氨，这一过程称为氨化亚硝酸盐还原^[2]。其他细菌在呼吸过程中使用硝酸盐和亚硝酸盐（NO₂^-）作为替代电子受体，并将它们转化为最终产物一氧化氮(NO)，一氧化二氮（N₂O）和N₂用于氧气受限时产生能量。这个过程通常发生在在厌氧条件下，这些最终产品会被释放到大气中。后一个过程是传统定义的反硝化途径^[3]，也是我研究的重点。

1.1.2氮污染的现状

水资源的开发遍布全球，因此保护水资源存在巨大压力。其重要目标之一是保护地表水资源免受人为活动影响。据观察，在过去的三四十年间，饮用水质量逐渐下降，这主要是由于水中硝酸盐浓度很高。许多国家报告说，自20世纪50年代以来，硝酸盐的水平已经大大增加。NO₃^-和NO₂^-是氮循环的一部分。硝酸盐是存在于所有生态系统中的天然化合物。它是植物生命必需的化学物质之一，但过多可能会给植物和动物带来各种问题。硝酸盐进入水体的来源主要包括地表径流，地表水流或地下水交换，农业实践，家庭和工业废物排放，污水和大气氮污染^[4]。

大气中的氮污染主要是氮氧化物。由于钢铁、水泥行业的兴起，以及煤炭等燃料的燃烧，人类向大气排放越来越多的氮氧化物。大气中氮氧化物增加会导致酸雨，平流层臭氧层破坏和光化学烟雾等。

1.1.3氮污染的危害

氮浓度高会致使水体富营养化。世界卫生组织建议饮用水中硝酸盐浓度的最高限值为50 mg / l NO₃^-，相当于11.3 mg / l的NO₃^--N。城市地区的废水大量排入地表水体，给公众造成了很大的环境健康隐患，这种情况主要是管理不善造成的。由于城市化的扩大，许多淡水河流和地下水的质量恶化，也加剧了这些水资源的枯竭。硝酸盐污染将对国民经济和人民的日常生活发展产生严重影响，必须引起足够重视。人为导致的硝酸盐的积累也造成了印度西海岸的缺氧^[5]。除了对地表水体造成生态问题之外，地下水中的硝酸盐还会持续数十年并积累到很高的水平，这将严重影响水质，威胁饮用水的安全^[6]。

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