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摘 要

1,5-戊二胺作为一种生物二元胺，在农产品加工生产、医疗保健和工业等领域具有广泛的应用。当前，为实现戊二胺的高效生物合成，利用微生物发酵法直接合成戊二胺的工艺研究受到广泛关注。然而，产物戊二胺对微生物生长以及产品合成具有显著抑制作用，很大程度上降低了1,5-戊二胺的发酵效率，限制了戊二胺的直接发酵合成。因此，为了提高戊二胺生产菌株的耐受性，本课题从实验室生产戊二胺的宿主细胞E. coli NT1003出发，通过常压室温等离子体诱变(ARTP诱变) 技术筛选高耐受性的戊二胺菌株，进而考察了突变菌株对戊二胺的耐受性能以及遗传稳定性，成功将E. coli NT1003对1,5-戊二胺耐受浓度从20 g/L提高到40 g/L。

关键词：1,5-戊二胺 耐受性 大肠杆菌 发酵法

Breeding of 1,5-pentadiamine-tolerant strains of Escherichia coli

Abstract

1,5-pentadiamine, as a bio-diamine, has been widely used in the fields of agricultural products processing, health care and industry. At present, in order to achieve high-efficiency biosynthesis of pentadiamine, the direct synthesis of pentadiamine by microbial fermentation has attracted wide attention. However, the product pentadiamine has a significant inhibitory effect on microbial growth and product synthesis, which greatly reduces the fermentation efficiency of 1,5-pentadiamine and limits the direct fermentation of pentadiamine. Therefore, in order to improve the tolerance of pentadiamine-producing strains, starting from the host cell E. coli NT1003 which produces pentadiamine in the laboratory, we screened pentadiamine-producing strains with high tolerance by atmospheric pressure room temperature plasma mutagenesis (ARTP mutagenesis), and then investigated the tolerance and genetic stability of the mutant strains to pentadiamine. The tolerance concentration of E. coli NT1003 to 1,5-pentadiamine was increased from 20 g/L to 40 g/L.

Key Words: 1,5-pentadiamine; Tolerance;Escherichia coli; Fermentation method

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文 献 综 述 1

1.1 1,5-戊二胺的性质及应用 1

1.2 1,5-戊二胺的生物合成方法 2

1.2.1 全细胞转化法 2

1.2.2 微生物发酵法 2

1.3 微生物诱变育种 3

1.4 本课题的研究意义 4

第二章 实验方法和材料 5

2.1 实验菌株 5

2.2 实验仪器 5

2.3 实验试剂 5

2.4 培养基与溶液的配置 6

2.5 E.coli NT1003菌株对戊二胺耐受性测定 7

2.6 菌株诱变及筛选 7

2.6.1 菌株生长曲线的绘制 7

2.6.2 诱变菌悬液的制备 7

2.6.3 ARTP诱变 7

2.6.4 初筛、复筛方法 8

2.7 突变菌株1,5-戊二胺耐受性验证 8

2.8 突变菌株稳定性考察 8

2.9 分析方法 8

第三章 实验结果与讨论 10

3.1 E.coli NT1003菌株对戊二胺耐受性 10

3.2 耐受菌株的筛选 11

3.2.1 菌株生长曲线的绘制 11

3.2.2 ARTP诱变时间的确定 12

3.2.3 ARTP诱变筛选戊二胺耐受性菌株 13

3.3 突变菌株戊二胺耐受性 14

3.4 突变菌株遗传稳定性测定 15

第四章 总结与展望 17

参考文献 18

致 谢 20

第一章 文 献 综 述

1,5-戊二胺广泛分布于原核和真核生物中，在许多领域展现出广泛的应用前景。特别是在工业领域，1,5-戊二胺可以与多种二元胺发生聚合反应合成高分子材料聚酰胺^[1]，其因具有多种优良的性能而能被广泛应用于各种产业当中。由于其具有耐高温的特点，因此在铁道建设、包装产业、电子电器产业和医疗器械生产行业起着重要的作用。此外由于其具有良好的抗磨损性，其在体育运动产品生产方面也扮演着重要的角色^[2]。20世纪以来，随着现代化工业的不断发展，尼龙产品在日常生产和生活中的使用越来越普遍，推测到2020年尼龙产品将占有167亿美元的市场份额^[3]。目前，全球聚酰胺（尼龙，PA）产品每年的消耗量大约3000万吨，且呈现逐年增长的趋势^[4]。1,5-戊二胺被广泛应用于聚酰胺产品的合成，其需求量也在日益增长。

主要的1,5-戊二胺的制备方法分为两大类。以石油为原料的化学法制戊二胺，容易造成严重的环境污染，不可持续发展，因此无法满足现代化工业发展的要求^[5]。相比于化学法，生物法合成^[6]戊二胺利用可再生资源为原料生产1,5-戊二胺，具有降低生产成本、保护环境和方便下游产品提取等优势。但生物法合成1,5-戊二胺也有一定的限制性因素，如1,5-戊二胺产品的产率及产量难以满足工业化生产的要求、菌株的1,5-戊二胺耐受性差、生物法操作复杂等。因此，解除发酵过程中戊二胺对菌体的抑制对生产戊二胺意义重大。

1.1 1,5-戊二胺的性质及应用

1,5-戊二胺，由赖氨酸的脱羧形成,其游离碱是一种无色到淡黄色的液体，保存后颜色会变深。1,5-戊二胺的盐酸盐可作为二胺氧化酶的基质和大肠杆菌DNA聚合酶的抑制剂。该物质易燃烧后形成具有很强的刺激性的气体，吸入人体后会因该物质的剧毒导致喉部、支气管水肿。中毒表现多样，主要包括咳喘、咽喉出现炎症、呼吸短促、头痛、恶心和呕吐，情况危机时也将导致死亡。

在食品领域^[6]中，其广泛存在于发酵酒产品中。许多科学研究表明，1,5-戊二胺对人类健康有造成影响，并且可以增强发酵类产品中组胺的毒性。因此，在食品生产过程当中，需要加大对戊二胺成分及含量的控制。因此，1,5-戊二胺含量的高低也能作为检测食品^[7]是否安全的标准，其在食品安全检测扮演了重要的角色。

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