论文总字数：18388字

摘 要

食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum）可以同时利用多种不同的C1原料进行发酵，如CO₂、CO、甲醇等，同其它菌株相对，其对甲醇的利用速率表现出明显的优势，因此开发食甲基丁酸杆菌作为甲醇利用的模式宿主，对促进甲醇的生物转化具有重要意义。然而当前研究中该菌株遗传操作工具的缺乏，限制了其的发展和应用。高效的转化策略是进行分子操作的基础，本文为建立食甲基丁酸杆菌高效的转化体系，考察了不同甲基化酶修饰对质粒转化效率的影响，同时对比分析了不同复制子的质粒对菌株的转化效率，确定了可在食甲基丁酸杆菌中稳定存在的复制子，此外为进一步提高转化的效率，分别从感受态细胞的制备过程（细胞壁弱化剂、细胞膜增溶剂）、电转参数（电压、电阻）、孵育过程（时间）三个方面进行系统优化，最终获得了高效的电转策略，质粒转化效率可达3170，较未优化前提高了约10倍。

关键词：甲醇 甲基化 复制子 转化

Establishment of high efficient electroporation method for Butyribacterium methylotrophicum

Abstract

Buttyribacterium methylotrophicum can simultaneously utilize a variety of C1 raw materials, such as CO₂, CO, methanol, etc.Compared with other strains, which shows a significant optimization of the utilization rate of methanol, so the development of methylbutyric acid As a model host for methanol utilization, Bacillus is important for promoting the biotransformation of methanol. However, the lack of genetic manipulation tools for this strain in the current study limits its development and application. Efficient transformation strategy is the basis of molecular manipulation. In order to establish an efficient transformation system of M. acidobacillus, the effects of different methylation enzyme modifications on plasmid transformation efficiency were investigated, and the plasmid pairs of different replicons were compared and analyzed. The transformation efficiency of the strain determines the replicon that can be stably present in M. acidobacillus, and further increases the efficiency of transformation from the preparation process of competent cells (cell wall weakening agent, cell membrane solubilizing agent), electrical parameters System optimization was carried out in three aspects (voltage, resistance) and incubation process (time). Finally, an efficient electrotransformation strategy was obtained. The plasmid conversion efficiency reached 3170, which was about 10 times higher than before optimization.

Key words: Methanol; methylation; replicon; transformation

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1甲醇的概要 1

1.1.1甲醇 1

1.1.2甲醇的市场 1

1.2食甲基丁酸杆菌性质概要 2

1.2.1食甲基丁酸杆菌 2

1.2.2食甲基丁酸杆菌发酵甲醇 2

1.2.3建立食甲基丁酸杆菌合适遗传操作体系的必要性 3

1.3 本论文的研究内容以及拟采用的手段 3

1.4本论文的研究意义 3

第二章 实验部分 5

2.1仪器与试剂 5

2.1.1仪器 5

2.1.2试剂 6

2.1.3培养基 6

2.2质粒构建 8

2.2.1基因克隆 8

2.2.2 酶切、连接和转化 9

2.2.3菌落PCR验证 10

第三章 实验结果 12

3.1食甲基丁酸杆菌感受态细胞的制备及质粒转化的探索 12

3.2 食甲基丁酸杆菌的固体培养基的筛选 12

3.3甲基化修饰系统及复制子对转化效率的影响分析 13

3.4食甲基丁酸杆菌感受态细胞制备的优化 15

3.4.1添加细胞壁弱化剂 15

3.4.2添加细胞膜弱化剂 16

3.4.3优化复苏时间 17

3.4.4优化质粒DNA添加量 18

3.4.5添加细胞洗涤液 19

3.5电转过程中的参数优化 20

3.5.1优化电压 20

3.5.2优化电阻 21

3.6优化后的转化策略 22

3.7讨论 23

第四章 总结 24

参考文献 25

致谢 28

第一章 文献综述

1.1甲醇的概要

1.1.1甲醇

甲醇，易挥发的有毒液体，可以从以化石燃料为基础的合成气中制备而得、直接从天然气甲烷中氧化而来或者还原大气中的氢气与二氧化碳制备甲醇^[2]。目前，甲醇产能以年均34%的速度增长，且由于规模化新增甲醇建设项目大批涌现，甲醇行业进入高速发展期。因此，近年来甲醇产能压力过剩等问题日益加剧^[3]。甲醇在非常重要的有机化工原料当中有一席之地，论及大气中的丰富有机物，它是仅次于甲烷的。在化学工业大生产中，甲醇利用量占总消耗量的75%，甲醇大多数作用于甲基化试剂、染料、树脂、农药、纤维、塑料、溶剂和防冻剂等工厂生产中。

1.1.2甲醇的市场

在有限的能源下，不断的开采提取化石能源是导致环境危机、能源枯竭的主要原因之一。为了缓解环境能源危机，寻求可持续的替代能源刻不容缓。开发生物技术路线，寻找可持续替代的转化方式，建立合适生物制造的方法，是缓解能源压力有效措施。目前，一碳化合物的高效利用是当前生物制造领域的重要研究热点^[1]

在传统的甲醇利用中，甲醛的生产是其产量的重要组成部分，占总产量的50%。而在新开发的甲醇应用中，如甲醇羰化合成醋酸^[2]、化工合成乙烯、乙二醇以及微生物发酵生产单细胞蛋白^[3]，均给甲醇生产的发展开拓出更为广阔的应用前景。特别是甲醇可作为一种清洁燃料，在替代燃料矿产上发挥重要的作用^[4]，如合成高辛烷值汽油，具有划时代的意义。与葡萄糖相比，甲醇具有以下优势：含有更多电子，能够提供充足还原力；来源广泛，可从工业废气或煤炭等较多可再生资源中高效合成；成本较低，运输便捷，供应不因季节和气候而影响。自2013年，George A. Olah提出了“甲醇经济”以甲醇为原料制造生活必需品^[5]，与传统碳源相比，甲醇成为微生物合成路线的一种重要的非食品替代基质，以此解决能源紧张问题，降低环境污染，缓解人类对化学工业原材料的巨大需求压力。

1.2食甲基丁酸杆菌性质概要

1.2.1食甲基丁酸杆菌

食甲基丁酸杆菌（Butyribacterium methylotrophicum），是一种厌氧芽孢菌，既能够催化多种单碳基质也可以催化基质混合物，单碳物质既能够提供碳源又可以提供能源^[6]。通过使用如H₂-CO₂，CO，HCOOH等氧化基质和一些其他物质，将食甲基丁酸杆菌用于发酵同源乙酸^[7]。通过使用诸如CH₃OH-CO₂或CH₃OH-HCOOH的小基质合成丁酸^[8]。TOP10感受态细胞^[9]是敲除了所有限制性修饰系统的感受态细胞，这很方便我们进行甲基化的修饰实验。

1.2.2食甲基丁酸杆菌发酵甲醇

在已知的嗜甲基微生物中，食甲基丁酸杆菌对甲醇的发酵是独一无二的，细胞产量和增殖速度比其它微生物都高^[10]。相较于H₂和丁酸，甲醇更容易被还原，导致含甲醇基和碳的电子受体在分子之间发生的氧化还原反应是生长必不可少的，这就解释了食甲基丁酸杆菌的独特性^[11]。研究人员对食甲基丁酸杆菌的报告集中在其发酵表型，即以不同的单碳物质作为底物和按一定比例进行发酵，揭示食甲基丁酸杆菌的生长和产酸产醇的能力。Andrew^[12]等人实验说明，食甲基丁酸杆菌可以直接以CO气体为基质生产正丁醇，五天后浓度可达2.7g/L。而以不同气体（CO₂和H₂）发酵结果来看，增加CO₂的浓度会加快初始生长速率并增加产物的形成^[13]。与此同时，¹³C研究揭示了某些单个碳化合物的代谢。乙酸位置¹³C-在两个分开的碳材料显示出一种趋势^[14]，当甲醇消耗，CO、CO₂或正式酸通常标记羧基位置时，它被消耗CO-CO₂和正式的酸包括乙酸甲组。位置：CO仍然作为更好的碳水化合物前体^[15]。甲基主要被甲醇相连，进入碳水化合物的物质有复合基质中的甲醇。所有这些都表明，与CO₂相关的两个独立的碳代谢途径形成了乙酸合成的一个例子^[14]。

1.2.3建立食甲基丁酸杆菌合适遗传操作体系的必要性

上述对食甲基丁酸杆菌的研究在于发酵水平和部分物质代谢的鉴定，结果显示食甲基丁酸杆菌生长速率较低，发酵周期长，在以甲醇等单碳物质为基质发酵时，代谢速率慢，利用基质生产化学品能力较差，难以满足生物制造和可持续生物转化的要求。为解决这些难题，建立合适的遗传操作体系是必不可少的。首先，需要建立高效的转化系统。非模式菌株食甲基丁酸杆菌体内含有限制酶^[16]，可将双链DNA切断，之后其他的内切酶再将切下的片段降解^[17]，因此能将入侵的外来DNA摧毁^[18]。为防止限制酶对外源质粒切割，需要对其进行甲基化修饰^[19]。不同复制子对应相应的拷贝数，考察在本菌株中合适的复制子。针对一般梭菌转化频率低下缺陷，着力优化转化条件，提高转化频率。根据建立的转化系统，调节甲醇代谢相关基因^[20]，增强甲醇代谢能力。

1.3 本论文的研究内容以及拟采用的手段

1.菌株最优固体培养条件的确立：选取适合梭菌生长的不同固定培养基，对食甲基丁酸杆菌进行培养，以存活率作为指标，选取最适的固体培养基。

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