论文总字数：18343字

摘 要

本课题主要研究氨基功能化离子液体修饰磁性纳米粒子的制备，以二醛淀粉为交联剂的漆酶固定化。固定化漆酶的pH稳定性、热稳定性、操作稳定性等酶学性能，以及固定化漆酶降解2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）的效能及影响因素考察。本研究制备了五种以Fe₃O₄纳米粒子为基础载体的固定化漆酶，通过与游离漆酶和其他四种固定化漆酶的对比，展现出Fe₃O₄-NIL-DAS@lac的优越性能。实验结果表明，与Fe₃O₄@lac 、 Fe₃O₄-NH₂@lac 、 Fe₃O₄-NIL@lac 、 Fe₃O₄-NIL-GA@lac 相比，Fe₃O₄-NIL-DAS@lac具有更高的固定化效率（85.8%）、酶载量(60.3 mg g^-1)、表观活性 (91.3 U g^-1)、比活性 (1514.1 U g^-1 蛋白) 和活性保留 (73.7 %)。在最佳pH催化条件下， Fe₃O₄-NIL-DAS@Lac在pH 7.5溶液中可完全去除2,4-DCP，比游离漆酶对2,4-DCP的去除效率提高了15% ,略高于Fe₃O₄-NIL@lac （93.6% ，pH 5.5）和Fe₃O₄-NIL-GA@Lac（90.7%，pH 5.5）。并且Fe₃O₄-NIL-DAS@Lac且具有良好的可重复利用性、储存稳定性、pH和温度稳定性。

关键词 漆酶 柔性固定化 离子液体 磁性载体 2,4-二氯苯酚

Laccase flexibly immobilized on magnetic nanoparticles modified by amino-functionalized ionic liquid for studying of 2,4-dichlorophenol biodegradation

Abstract

The main research contents of this topic include: preparation of amino-functionalized ionic liquids modified magnetic nanoparticles , immobilization of laccase with dialdehyde starch as cross-linking agent , the enzyme properties of immobilized laccase include pH stability, thermal stability and operation stability ,the efficacy and influencing factors of immobilized laccase degradation of 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP). In this study, five laccase immobilized supported on Fe₃O₄ nanoparticle carriers were prepared, and compared with free laccase and four other immobilized laccase, the superior performance of Fe₃O₄-NIL-DAS@lac was demonstrated. The experimental results show that compared with Fe₃O₄@lac, Fe₃O₄-NH₂@lac, Fe₃O₄-NIL@lac and Fe₃O₄-NIL-GA@lac, Fe₃O₄-NIL-DAS@lac had higher immobilization efficiency (85.8%), enzyme loading (60.3 mg g^-1), expression activity (91.3 U g^-1 biocatalyst), specific activity (1514.1 U g^-1 protein) and activity retention (73.7%) . Fe₃O₄- NIL - DAS@Lac can completely remove 2,4-DCP in pH 7.5 solution, which is 15% higher than free laccase under optimal pH catalysis, slightly higher than Fe₃O₄-NIL@lac (93.6%, pH 5.5) and Fe₃O₄- NIL - GA@Lac (90.7%, pH 5.5). Moreover, Fe₃O₄-NIL-DAS@Lac has good reusability，storage stability, pH and temperature stability.

Key Words: Laccase; Flexible immobilization; Ionic liquid; Magnetic carrier; 2,4-dichlorophenol

目 录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 含酚工业废水及其危害简介 1

1.2 漆酶的简介及固定化 1

1.2.1 漆酶的简介 1

1.2.2 固定化技术 2

1.2.3 固定化载体 2

1.2.4 柔性固定化 3

1.2.5 离子液体 4

1.3 本实验的思路和方法 4

第二章 材料与方法 6

2.1 实验材料 6

2.2 实验步骤 6

2.2.1 Fe₃O₄-NIL纳米粒子和Fe₃O₄-NH₂纳米粒子的合成 6

2.2.2 Fe₃O₄-NIL-GA纳米粒子和Fe₃O₄-NIL-DAS纳米粒子的合成 7

2.2.3 固定化漆酶 7

2.2.4 漆酶活性测定 8

2.2.5 2,4-二氯苯酚的酶去除 8

2.2.6 游离和固定化漆酶的储存稳定性 9

2.2.7 固定化漆酶的可重复使用性 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 漆酶的固定化和活性 10

3.2 酶去除2,4-二氯苯酚的研究 11

3.2.1 pH对酶去除酚的影响 11

3.2.2 温度对酶去除酚的影响 12

3.2.3 酶去除酚的时间依赖性 13

3.3储存稳定性研究 14

3.4固定化漆酶可重复使用性研究 15

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 含酚工业废水及其危害简介

从石化，冶金，染料，化学有机合成和药物等各种工业领域排出的工业废水里的酚类化合物因为细胞质毒素而对生物和环境构成十分严重的威胁。含有酚类的有机废水是全世界最具有污染性和危害性的工业废水之一，因此含酚废水受到了美国环境保护署和欧盟委员会的严格控制。由于酚类在水中非常稳定并且即使在低浓度下也具有致癌性，因此学者们已经提出了许多处理方法，例如物理化学方法和生物方法[1-2]。尽管如此，传统的物理和化学处理方法仍然存在着一些不可避免的问题，特别是二次污染。生物处理含酚工业废水因其对环境的友好性和催化效率高而受到广泛关注[3-4]。

1.2 漆酶的简介及固定化

1.2.1 漆酶的简介

漆酶(EC1.10.3.2) 是一类多酚类单电子氧化还原酶（ρ-二元酚氧化酶），以铜为催化活性中心，以单体糖蛋白的形式存在，是自然界中广泛存在的铜蓝氧化还原酶家族，具有较强的氧化还原能力，作用的底物相当广泛。已被证明能够成功催化酚类、芳香胺类、杀虫剂和某些染料的降解，其唯一的降解副产物是水。因此，漆酶由于其广泛的底物范围和高效的催化性能而在许多领域引起了极大的关注，特别是在工业废水的处理中。漆酶的活性中心由四个铜离子组成，包括一个T1、一个T2和两个T3铜中心。酚类化合物在漆酶的T1铜中心被氧化，形成活性自由基，并与活性自由基偶合形成多聚体，从水中沉淀分离并降低毒性。然而，游离漆酶不容易从催化体系中分离达到重复使用的目的，并且对环境因素敏感、不稳定，在使用过程中容易受到温度、pH等环境条件变化的影响而变性失活，致使工业应用的成本较高，从而漆酶在各个领域的应用受到了限制。杨波等人在文献中报道了漆酶的结构以及催化反应机理，漆酶催化氧化有机污染物的反应需要氧气参，它的机理主要体现在这两个方面：产生底物自由基中间体和氧气还原成水，着重报道了漆酶的固定化方法和固定化载体[5]。举例了姜德生等人有关将纳米技术与磁处理相结合制备磁性纳米载体的研究[6]。

1.2.2 固定化技术

酶固定化技术是弥补游离酶缺陷的理想途径。开发了多种固定化酶的载体，包括无机材料、有机材料和复合材料。其中，无机纳米材料以其表面积大、酶载量高等优点受到固定化酶领域的欢迎。Fe₃O₄磁性纳米材料具有毒性小、合成工艺成熟、与基体分离快、循环催化性能好等优点。一般来说，由于Fe₃O₄磁性纳米粒子具有惰性表面行为，很难将酶加载到亲本Fe₃O₄上，从而获得具有高效催化性能的高质量固定化酶。此外，表面能大、磁性强的纯Fe₃O₄易在液体中团聚，降低了固定化效率和固定化酶的活性。杜东霞等人报道了漆酶固定化的一些基本方法，并对这些方法进行了较为系统的比较，重点报道了漆酶固定化的发展和创新，其中包括交联酶聚集体技术、定向固定化技术、利用反胶束的漆酶固定化技术[7]。而交联酶聚集体(CLEAs)是由Cao（荷兰德尔福特理工大学）等人在2000年率先提出的一种新型的酶固定化技术[8]。

1.2.3 固定化载体

合适的载体应提供具有高酶活性和负载量的固定化酶，稳定的物理化学性质，优异的机械强度和高的底物亲和力，这是依赖于单一无机载体难以满足的。在文献中，已经尝试将有机和无机载体组合以利用它们各自的优点并获得令人惊讶的结果。淀粉是一种含有大量羟基的有机高分子材料，与酶具有良好的生物相容性，能显著保持酶的活性，有利于提高固定化酶的底物亲和力。物理吸附的固定化方法是基于酶与载体之间的相互作用，如静电力、氢键和范德华力等，弱力容易导致酶分子从载体上脱落。因此，通常用交联剂来固定化酶，以改善酶的性能。纳米技术与磁处理结合制备磁性纳米载体的研究得到广泛关注。例如刘宇等人制备了通过氨基修饰的磁性SiO₂纳米粒子载体，以戊二醛为交联剂固定漆酶[9]。近年来，磁性纳米颗粒的研究内容主要涉及到在磁性纳米颗粒的表面覆盖羟基、羧基、氨基等官能团。伴随着生物技术的突飞猛进的发展，漆酶的固定化方法也在不断的改进，漆酶对有机工业废水中氯酚类污染物处理的成本不断降低的同时，处理效率也在不断提高。晁聪等报道了对埃洛石纳米管(HNTs)表面的改性及其固定漆酶性能的研究，在实验中改善HNTs的分散性以及提高固定化酶在HNTs的负载量，证明了PVA/HNTs复合颗粒可以作为酶固定化的优良载体[10]。王珏玉等报道了多种固定化漆酶磁性载体的制备方法、催化性能以及应用，由此概括了多种磁性载体的特点，通过比较分析这些固定化漆酶磁性载体的负载量和固定化漆酶的活性回收率，为固定化漆酶磁性载体的开发应和用提供帮助[11]。如Kumar等人利用戊二醛(GA)交联法将漆酶固定于经过3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)修饰的Fe₃O₄-NPs表面，固定漆酶后的磁性纳米粒子的直径介于48～74 nm之间,负载量高达155 mg/g,但漆酶活性回收率仅为32%，可能是由于交联的方式阻碍了漆酶和催化底物的结合[12]。Lin等利用交联作用在Fe₃O₄上负载一层壳聚糖,然后将Cu² 和Mn² 螯合在Fe₃O₄磁性壳聚糖微球表面，通过调整溶液的PH值使漆酶带上负电荷，带负电荷的漆酶与Fe₃O₄,磁性壳聚糖微球表面上的阳离子结合,使漆酶固定在磁性微球上[13]。

1.2.4 柔性固定化

传统交联剂会与酶发生剧烈反应，导致酶活性丧失。为此，提出了柔性固定的概念。富含活性醛基的二醛淀粉不仅具有淀粉的优点，而且是一种柔性固定化的交联剂。长链聚合物具有优异的构象柔韧性，出色的链移动性和静电排斥性，可降低空间扩散限制，有效防止结块，提高固定化酶的活性保留。Chen Chao等报道了通过使用二醛淀粉（DAS）形成柔性间隔臂与酶结合的一种新型聚多巴胺制备的Fe₃O₄纳米粒子，表明生物相容性微环境和粒子界面处的柔性束缚似乎能有效的提高固定化酶的性能[14]。在使用漆酶的测试中，这样制造的纳米颗粒酶载量高(242 mg/g)，保留的特定酶活性也高(69%)，同时，间隔臂促进的固定化减少了构象变化。此外，与游离漆酶相比，固定化酶显示出大大提高的抗pH和热灭活稳定性。测试从水中除去2,4-二氯苯酚和更多的污染物时，固定化的漆酶表现出高的降解效率和可重复使用性,证明了使用生物基聚合物制备纳米材料制备高性能生物催化剂的新方法。Cabana等用聚乙二醇作为沉淀剂，戊二醛作为交联剂，BSA作为稳定剂，第一次成功制备了漆酶交联聚集体[15]。

1.2.5 离子液体

离子液体独特的结构被证明可以有效地保持酶活性，增强稳定性，提高可重用性[16]。据报道，ABTS作为电子介体可以促进漆酶的催化作用。因此，检测ABTS对固定化漆酶降解酚的影响。此外，结合一系列光谱表征分析载体和固定化漆酶，以探索改善的漆酶活性，储存稳定性和可重复使用性的机理。Qiu Xiang等以功能性离子液体作为漆酶固定化的桥联剂制备了有机-无机纳米复合材料，并将其应用于2,4-二氯苯酚的脱除，显示了功能性离子液体的重要作用[17]。

1.3 本实验的思路和方法

对于酶固定化及其对酚类处理的研究受到了广泛关注，将纳米技术与磁处理技术结合制备磁性纳米载体的方法是重要的固定化酶方法。王美银等报道了漆酶及其固定化的多种方法，固定化漆酶在染料废水中高效处理的效果[18]。赵林果等人通过自制丙烯酸脂类聚合物的复合型载体来固定化漆酶，并对染料酸性紫4进行脱色处理，发现在脱色4h后，脱色率达到了98.5％，重复使用8批次后，脱色率仍能保持在90％以上[19]。Xu Ran等报道了一种新的漆酶固定化方法，即电纺壳聚糖/聚乙烯醇复合纳米纤维膜上漆酶固定化方法[20]。实验中通过戊二醛交联将漆酶固定在膜上，并研究了其物理、化学和生物化学性质，以及它在2,4-二氯苯酚去除中的应用。在最佳条件（pH 4, 10h）下，膜上的漆酶负载量为约853 mg/g。与游离漆酶相比，固定化漆酶对pH、温度和振荡的变化不太敏感，从而表现出更高的稳定性和可重复使用性。通过2,4-二氯苯酚的降解评价游离和固定化漆酶的催化性能，固定化漆酶对2,4-二氯苯酚的去除效率在最佳条件（pH 6, 50℃）下6h后约为87.6％，远高于游离漆酶（82.7％），表现了新型固定化方法的优越性。

在各位学者前辈们对固定化酶的探索和研究的工作基础上，本课题进行了进一步的研究。本课题采用氨基功能化离子液体修饰Fe₃O₄磁性纳米粒子，并通过席夫碱反应与二醛淀粉结合。同时，二醛淀粉作为交联剂，使载体与漆酶共价键合。随后，将游离漆酶和固定化漆酶应用于2,4-二氯苯酚的去除，考察温度、pH和时间对2,4-二氯苯酚去除效率的影响。

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

FeCl₃·6H₂O，FeCl₂·4H₂O，NH₃·H₂O（28％），戊二醛（GA）和2,4-二氯苯酚（2,4-DCP）购自国药化学 试剂有限公司。来自米曲霉的漆酶由中国宁夏孙逊公司提供，保存于0-4℃。3-氯丙基三甲氧基硅烷（CPTMO）由上海生物科技有限公司提供。咪唑，NaBF₄和2, 2 -联氮 - 二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）得自能源化工（中国上海）。3-氨基丙基三甲氧基硅烷（KH-540）购自阿达玛斯（中国上海）。 2-丁基乙胺氢溴酸盐由九鼎化学（中国上海）提供，二醛淀粉（DAS）购自泰安金山改性淀粉有限公司。

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