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1. 研究目的与意义及国内外研究现状

选题的目的：

在贻贝中已发现的高粘性的蛋白质吸引了很多科学家的关注。经研究发现，这些蛋白中含有大量的二羟基苯丙氨酸（Dopa）。对此类蛋白的进一步研究揭示赖氨酸残基常在多巴的邻位出现，二者的同时出现可以增进此类蛋白的粘附能力。本报告中对关于含有多巴的组装体系统进行了综述，旨在指导我们能够制备二肽Dopa－Lys并将该序列引入到高分子中以增强该高分子溶液的粘附效果。

选题的意义：

目前，提高胶和组织的亲和性还未研究透彻，而这次研究因为赖氨酸具有抗菌性，更加优化了该高分子胶的抗感染功能。又因为多巴中的邻苯二酚较强的粘附性，同时又能较好的进行组织粘附，有利于伤口愈合。因此具有Dopa-Lys二肽序列的高分子胶很可能用于生物医学方面的伤口修复等组织工程领域。

国内外研究现状

一、前言

1.1 水凝胶

水凝胶是一种充满大量水分子的三维立体网络¹，通过物理或化学交联作用纤维并进一步形成了多孔结构。水凝胶可分为高分子水凝胶和超分子水凝胶两类。而按照成胶分子间相互作用的不同又可分为共价交联水凝胶和非共价交联水凝胶两大类。其中，共价交联聚合物水凝胶可通过浓度，交联密度或分子结构改变，这些水凝胶通常由非天然单体制成。而非共价交联聚合物水凝胶是经过非共价相互作用造成的，非共价相互作用主要有离子键作用，氢键作用，π-π共轭效应和疏水效应。

另外，超分子水凝胶大多是非共价交联形成的，最常用于多肽。由于是非共价的相互作用组装，在经受破坏后可以恢复超过90%的机械性能²，生物相容性好，可以降解为天然氨基酸，也可以很容易地纳入多种生物活性的抗原表位。但是在生理条件下，低应变需抗力来受压。

小分子多肽水凝胶在组织工程中大量运用^3-4。在大多数情况下，肽序列与细胞结合以促进特定的生物学反应，如细胞粘附或受体信号转导。多肽也是通过非共价相互作用来改变水凝胶的机械性能。这可以既做出一种具有聚合物水凝胶的应变阻力，又可以像肽水凝胶那样回收和组装的杂化水凝胶。

1.2 肽

1.2.1 多肽

两个或两个以上的氨基酸经过肽键作用，衔接而成的化合物叫做肽。二肽则是两个氨基酸经过肽键作用衔接而成的，多肽又是10个以上的氨基酸组成的。什么是肽键呢？就是一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基少了一分子的水而形成了-CO-NH-的酰胺键，这叫做肽键。什么叫做肽链？即氨基酸之间通过肽键连接而成的肽链。在肽链中，有两个端，一个为N端，一个为C端。N端叫做氨基端，带自由氨基，一般在肽链的左边；C端叫做羧基端，带自由羧基。然而，肽链中的氨基酸因为形成了肽键的原因，已经失去了一分子的水，呈现一种不完整的分子结构，所以是氨基酸残基。

1.2.2肽键理论

肽键理论就是在蛋白质呈现阳性双缩脲反应的基础上，1888年提出的关于蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式为肽键的理论。蛋白质的阳性双缩脲反应是碱性CuSO₄出现浅红至紫蓝色，因为凡是呈现阳性双缩脲反应的化合物，它的分子都含有2个以上的-CO-NH-原子团，这说明蛋白质中含有-CO-NH-原子团。到1902年，E.Fischer人工合成了十八肽，进一步肯定了肽键理论的正确性。

二、多巴的黏合机理

2.1多巴来源

多巴的来源是一种生物——海洋贻贝，海洋贻贝是靠分泌一种蛋白——黏附蛋白，来附着在水下的岩石礁石的表面（图1），可以牢固的附着在激流的，潮湿的，盐碱的环境下⁵，甚至可以粘附在超疏水材料聚四氟乙烯(PTFE)上。天然贻贝足蛋白已经从不同种类的贻贝中提取出，来达到粘结力较强的材料^6-7。在过去的发展中，水下胶粘剂取得了显著的成就，应用于骨封闭⁸，牙科和医学移植⁹，冠状动脉涂层¹⁰，细胞包封¹¹和其他系统。为了进一步的研究离子水下胶粘剂，我们可以模仿现有生物胶如含贻贝足蛋白（MFP），将胶结构创造仿生合成胶粘剂¹²。

图1 贻贝表面的黏附方式

而多巴正是这种黏附蛋白的黏附作用的主要成分^13-14。由此，我们可以认为，多巴具有较好的黏附作用。如果我们将多巴引入氨基酸和肽中，可能合成产物也会表现出很好的黏性。

2.2多巴的黏性来源

从图2可以发现，它们的氨基酸序列中有很多的多巴氨基酸残基，而多巴残基中，邻苯二酚正是黏性来源^15-16。可以做很好的粘合剂^15，17。

图2 贻贝表面接触的蛋白质结构

2.3邻苯二酚的黏性作用

图3邻苯二酚氧化成醌

邻苯二酚在某些条件下，易被氧化成邻苯二醌，邻苯二醌之间可以发生蛋白质交联，从而使黏性加强^18-19。 Patrick Wilke and Hans G. Brner²⁰研究出基于肽类聚合物结合物的酶活性聚合物涂层。发现酪氨酸酶是用来启动贻贝胶衍生肽段的粘附功能，导致生物合成。该涂层能抵抗海水处理，并通过降低蛋白质吸附量来调节表面性能。

图4

说明了一种多肽-聚合物结合物的酶活化，生成了多巴-醌残基，这大大改善了所衍生的mefp-1的粘附性能和化学结构。

2.4 多巴中邻苯二酚的研究进展

由于含多巴共聚物的合成受限于所需的多个反应步骤，Keiji Numata and Peter James Baker²¹通过两种酶反应合成了含DOPA和L-赖氨酸的粘附肽，即木瓜蛋白酶I(Papaya Peptidase I)合成L-酪氨酸和L-赖氨酸共聚肽，以及酪氨酸酶将L-酪氨酸酶转化为DOPA。从收率、聚合度、多肽组成等方面对合成产物进行了表征。此外 通过核磁共振和氨基酸分析，定量评价酪氨酸对酪氨酸酶的转化。所得到的肽的粘合性质，由以下组成：多巴、赖氨酸和酪氨酸，在不同pH值水平进行不同的质子化和去质子化状态。

图5

Pegah Kord Forooshani, Bruce P. Lee²²在最近的研究中发现多巴邻苯二酚侧链可能发生的相互作用和反应的产物有很多，在图6中，A是邻苯二酚形成氢键组，B是和另一个苯环π-π电子相互作用，C是与带正电荷的离子阳离子-π相互作用，D是与金属离子螯合形成自愈交联，E是与金属氧化物表面形成配位键，F,G是多巴氧化成半醌和醌，具有高度活性，H是醌异构形成醌甲基和α-β脱氢多巴，导致邻苯二酚基团之后的聚合，I是醌与另一个邻苯二酚部分形成二聚体，J是醌与组织表面亲核物质（如-NH₂,-SH）反应，导致共价交联。

图6

2. 研究的基本内容

接下来我会先通过将H-Dopa-OMe加上Fmoc基团，然后经对甲苯磺酸的催化作用下对邻苯二酚进行保护生成缩酮Fmoc-Dopa(ac)-OMe，再用异丙醇，氢氧化锂和氯化钙在水溶液下使其脱去甲基，得到Fmoc-Dopa(ac)-OH。（图7）在每一步的过程中，都需要通过柱层析分离和TLC来点板进行产物的确认。

然后使H-Lys(Boc)-OMe与上面合成得到的Fmoc-Dopa(ac)-OH在DIPEA/EDC下进行耦合反应，可能得到化合物Fmoc-Dopa(ac)-Lys(Boc)-OMe（图7）。接着可用二乙基胺脱除Fmoc保护，使所得产物与肉桂酸在EDC／DIPEA作用下进行耦合，制备肉桂酸衍生的二肽Cin-Dopa(ac)-Lys(Boc)-OMe（图8）。

图8

3. 实施方案、进度安排及预期效果

在肉桂酸衍生的二肽cin-dopa(ac)-lys(boc)-ome的基础上，我们可以预先脱除酸性敏感保护基团二甲基缩醛（ac）与boc基团，再将所得产品与丙烯酰胺等水溶性烯烃化合物按一定比例进行混合后在特定条件下进行聚合，或聚合后再脱除这些酸性敏感基团，制备富含dopa-lys的高分子。通过透析等操作移除小分子后，可以配置不同的高分子水溶液，研究其粘附效果 ^23-24。

甚至可以通过聚合反应得到富含dopa-lys的（图9）、与贻贝上的mfp-5（图10）相似的高分子胶，这种胶应该具有一定的黏性，可以应用于仿生敷料，同时可能具有较好的伤口修复能力和防水性²⁵。

4. 参考文献

参考文献

[1]hoffman a s.hydrogels for biomedical applications[j].advanced drug deliveryreviews,2002,54(1):3-12.

[2]haines-butterick, l.; rajagopal, k.; branco, m.; salick, d.; rughani, r.; pilarz,m.; lamm, m. s.; pochan, d. j.; schneider, j. p.proc. natl. acad. sci. u. s. a. 2007, 104 (19), 7791.