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摘 要

本研究建立了普通PCR体系及SYBR Green I实时荧光PCR体系，实现了鱿鱼品种中太平洋褶柔鱼的分子鉴定。通过GeneBank查找太平洋褶柔鱼的细胞色素c氧化酶亚基I(COI)的核苷酸序列，进行多重序列对比，设计特异性引物，并建立鉴定太平洋褶柔鱼的PCR体系及荧光PCR体系。

在上述鉴定体系的基础上加入一对已验证的阿根廷滑柔鱼特异性引物，建立太平洋褶柔鱼与阿根廷滑柔鱼的双重PCR及双重荧光PCR鉴定方法。结果显示，在多重PCR和多重荧光PCR体系中，可根据阿根廷滑柔鱼与太平洋褶柔鱼的扩增产物电泳条带或熔解曲线与其他物种进行区分。最终建立的多重PCR体系及多重荧光PCR体系可以对阿根廷滑柔鱼和太平洋褶柔鱼及其制品进行准确的分子鉴定。

关键词：品种鉴定；鱿鱼制品；实时荧光PCR；多重PCR

Establishment and application of SYBR Green I real-time PCR method for detecting Todarodes pacificus

Abstract

In this study, a PCR system and a SYBR Green I real-time PCR system were established to realize the molecular identification of Todarodes pacificus. Use GeneBank to find the nucleotide sequence of Cytochrome Oxidase Subunit I (COI) of Todarodes pacificus, and multiple sequences were compared to design specific primers, and establish a PCR and a real-time PCR system for identifying Todarodes pacificus.

On the basis of the established Todarodes pacificus identification system, a pair of verified Illex argentines specific primers were added to establish a multiplex PCR and a multiplex real-time PCR identification method for Todarodes pacificus and Illex argentines. The results show that in the multiplex PCR and multiplex real-time PCR systems, it can be distinguished from other species according to the electrophoretic bands or melting curves of the amplification products of Todarodes pacificus and Illex argentines. Finally,the established multiplex PCR system and multiplex real-time PCR system can be used for accurate molecular identification of Illex argentines and Todarodes pacificus and their products.

Key Words: Variety identification; squid products; real-time PCR; multiplex PCR

目 录

摘要……………………………………………………………………………… I

ABSTACT …………………………………………………………………………II

第一章 文献综述 1

1.1 太平洋褶柔鱼（Todarodes pacificus） 1

1.2 水产品品种掺假 2

1.2.1 食品掺假 2

1.2.2 水产品品种掺假 2

1.3 基于DNA的检测方法 3

1.3.1 DNA条形码（full DNA barcoding, FDB） 3

1.3.2 多重PCR技术（multiplex PCR） 5

1.3.3 荧光PCR技术（real-time PCR） 5

1.4 课题意义 6

第二章 材料与方法 8

2.1样品采集 8

2.2 主要仪器 9

2.3 主要试剂 10

2.4 实验方法 10

2.4.1 DNA提取 10

2.4.2 引物设计与优化 11

2.4.3 普通PCR 12

2.4.4 荧光PCR 13

第三章 实验结果与讨论 15

3.1 DNA 提取 15

3.2 引物退火温度优化及特异性验证 15

3.3 双重普通PCR 17

3.4 双重荧光PCR 18

第四章 结论与展望 20

4.1结论 20

4.2展望 20

参考文献 21

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1 太平洋褶柔鱼（Todarodes pacificus）

在我国，每年鱿鱼的捕获量大约四十万吨上下，约为全球总量的三分之一。从二十世纪九十年代到现今，我国进口鱿鱼原料的数量在逐年上升，且我国出海捕捞鱿鱼的鱿钓业持续不断地发展着，我国鱿鱼生产和加工的产量扩大，其加工副产物量也呈逐年递增趋势。我国目前主要的鱿鱼加工制品类型有鱼糜制品、休闲调味制品和冷冻调味制品等。主要的鱿鱼加工副产物包括鱿鱼内脏、鱿鱼皮、墨囊、鱿鱼眼和鱿鱼软骨等^[1-2]。我国常将太平洋褶柔鱼作为加工制品的三大原料品种之一(其他两个品种为秘鲁茎柔鱼和阿根廷滑柔鱼）。

图1 2017年世界主要头足类品种产量（ref）

Fig 1 Global output of commercial cephalopod species in 2017

太平洋褶柔鱼属柔鱼科、褶柔鱼属。在日本和韩国的头足类产品销售市场上，太平洋褶柔鱼是主要的捕捞物种之一（图 1）。我国的太平洋褶柔鱼主要分布于黄海和东海北部。太平洋褶柔鱼在东海海域的资源量丰富，在东海海域头足类捕捞资源中有较为重要的地位^[3]。

郝振林等^[4]在太平洋褶柔鱼的肌肉组织中检测出14种脂肪酸，其中包含9种不饱和脂肪酸(UFA)。除此之外，郝振林等还在太平洋褶柔鱼中检测出了17种氨基酸，其中必需氨基酸的比例达到48.89%。因太平洋褶柔鱼中呈味氨基酸(DAA)含量丰富^[4]，其制品拥有较好的风味。该物种的营养价值较高且风味佳，因此太平洋褶柔鱼及其制品受到了广大消费者的喜爱。

1.2 水产品品种掺假

1.2.1 食品掺假

近年来，食品掺假的行为引起了人们广泛的讨论。食品掺假是指人为地向食品中加入不属于该食品标签所标识的符合合法食品生产活动的原料、添加剂等非固有成分的行为。例如，非法在食品中用形似或性状相似的物质与原材料进行替换；掺入同一种类原料中的品质更为低劣的原材料；或用人造的仿制品冒充某种食品并在市场上进行销售。

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