摘 要

蛋白质糖基化是自然条件下最普遍的蛋白质翻译后修饰，会对蛋白质折叠、定位及蛋白间的相互作用等生物进程产生重大影响。许多研究表明，不同的N-糖链组成可作为许多重大疾病，如神经退行性疾病,代谢性疾病和肿瘤等，的预测和诊断的生物标志物。因此，对N-糖链进行准确的高灵敏度检测具有重要意义。

基质辅助激光解吸质谱法以其检测灵敏度高、高通量以及对样品要求较低等优势，成为目前应用最为广泛的糖链分析技术之一。但是，质谱法直接检测N-糖链依旧存在以下困难：1）中性N-糖链自身离子化效率低；2）酸性N-糖链在离子化过程中易丢失糖单元；3）生物样品中存在的大量基质对N-糖链形成竞争性电离；

为解决上述问题，实现N-糖链的准确检测，本论文提出了一种基于肼标记与甲胺化的“一管式”双重衍生化技术，具体内容如下：

1. MALDI质谱法监控模型聚糖麦芽七糖与针对聚糖还原端的肼标记衍生试剂：GP（吉拉尔特试剂 P）与GT（吉拉尔特试剂 T）的标记反应，并探索优化衍生条件。
2. 在此基础上，利用GP试剂对RNase B酶解后N-糖链进行肼标记，并进一步优化衍生条件；
3. 针对Fetuin中唾液酸化N-糖链，先进行甲胺化衍生，其次进行肼标记，MALDI质谱法监控并优化衍生化条件。
4. 将优化后的双重衍生化技术用于人血清中N-糖链的MALDI质谱法检测。

研究结果表明，通过双重衍生化前处理技术，能提高N-糖链检测灵敏度还同时有效检测生物样品中中性和酸性N-聚糖。

关键词：N-糖链；肼标记；甲胺化；MALDI质谱

Abstract

Many researches have proved that N-glycans are potent biomarkers for various diseases and N-glycan profiling has become essentially important in biological and clinical researches.

Mastrix Assisted Laser desorption mass sepctrometry(MALDI-MS) has become one of the most important methods for N-glycan analysis, by the virtue of high sensitivity, high throughput, ease of operation, etc. However, direct analysis of N-glycans by mass spectrometry is challenging, due to the factors listed below: 1) the intrinsic low ionization efficiencies of neutral N-glycans; 2)degradation of acidic saccharide residues before detection; 3)signal suppression by other molecules in biomixtures.

In this work, a co-derivatization mehod, including methylamination and hydrazine derivatization, was developed for both neutral and acidic N-glycan profiling from biosamples using MALDI-MS. The major contents were summarized as below:

1.Maltoheptaose was selected as a model oligosaccharide to be labeled with hydrazine reagents, Girard's reagent P and Girard's reagent T, respectively. Reation parameters, such as molar ratios of Maltoheptaose to derivatization reagents, reaction times, reaction temperatures, et al. were optimized to maximize the derivatization efficiencies. Girard's reagent P was preferred due to its shorter derivatization time, compared with Girard's reagent T.

2. The optimized derivatization parameters were adopted for the analysis of N-glycans, released from RNase B by PNGase F enzyme method. MALDI-MS results show that all N-glycans of RNase B were identified with high sensitivity.

3.Co-derivatization strategy, methyamination followed by hydrazine derivatization, was applied to analyze sialylated glycans, released from Fetuin. MALDI-MS results show that all sialylated glycans of fetuin were identified with high sensitivity.

4. The developed strategy was applied to analyze N-glycans from human serum, more than 20 glycans, including sialylated glycans, were indentified simultaneously from one serum sample.

The “one-pipline” co-derivatization strategy has for the first time, enhanced the detection sensitivities of both neutral and acidic glycans in one biological sample, showing its great potential for N-glycan profiling from trace-level samples.

Key Words：N-glycan;hydrazine;methylamine;MALDI mass spectrometry;

目 录

第1章 绪论 3

1.1 蛋白质的糖基化 3

1.1.1蛋白质糖基化修饰的意义 3

1.1.2 糖基化简介 3

1.2 基于质谱的糖链的检测 5

1.2.1 糖链的释放 5

1.2.2 糖链的衍生方法 5

1.2.3 糖链的分离纯化和富集 7

1.2.4 质谱检测方法 8

第2章 基于肼试剂的N-糖链的衍生条件优化 9

2.1 引言 9

2.2 实验部分 9

2.2.1 材料与试剂 9

2.2.2 仪器设备 9

2.2.3 实验步骤 9

2.3 结果与讨论 10

2.3.1 GP、GT衍生试剂与麦芽七糖反应优化反应摩尔比 10

2.3.2 GP、GT衍生试剂与麦芽七糖反应优化反应温度 11

2.3.3 GP、GT衍生试剂与麦芽七糖反应优化反应时间 12

2.3.4 关于此肼衍生反应的检出限的分析 14

2.4 小结 14

第3 章 基于MALDI质谱的核糖核酸酶 B（RNase B）中N-糖链的分析 15

3.1 引言 16

3.2 实验部分 16

3.2.1 材料与试剂 16

3.2.2 仪器设备 16

3.2.3 实验步骤 17

3.3 结果与讨论 18

3.4 小结 18

4.1 引言 19

4.2 实验部分 19

4.2.1 材料与试剂 19

4.2.2 仪器设备 19

4.2.3 实验步骤 19

4.3 结果与讨论 21

4.4 小结 23

5.1 引言 23

5.2 实验部分 24

5.2.1 材料与试剂 24

5.2.2 仪器设备 24

5.2.3 实验步骤 24

5.3 结果和讨论 26

5.4 小结 27

参考文献 27

致 谢 31

第1章 绪论

1.1 蛋白质的糖基化

1.1.1蛋白质糖基化修饰的意义

蛋白质糖基化是基因在转录和翻译后最重要的修饰之一，而目前已知真核蛋白中超过半数的蛋白存在糖基化修饰。这些糖蛋白广泛分布于细胞、组织及体液中，特别是在细胞膜上和体液中含量丰富。比如，细胞外壁被一层“糖被（Glycocalyx）”^[1]所包覆，因此糖基化与细胞的易裂、细胞细胞相互作用等重要行为密切相关，如：发育、肿瘤发生与转移、免疫、传染及再生中发挥重要的作用。

糖基化修饰与许多生理过程息息相关。多细胞生物中细胞有相互识别而聚成细胞群的能力，这正是通过胞外基质中的细胞粘着分子(cell adhesion molecule, CAM)^[2]或粘着蛋白完成的，CAM绝大多数都是含N-糖链的糖蛋白。糖蛋白的分泌与稳定离不开糖基化的修饰，免疫球蛋白若缺乏N-糖链则不能分泌到胞外而留在内质网中。参与免疫反应的绝大多数分子都是糖蛋白，如免疫球蛋白、细胞因子、粘附分子、白细胞分化抗原等，它们的糖链结构参与B细胞的活化、T细胞的活化与凋亡、抗原的处理与呈递，并对淋巴细胞的激活与凋亡、抗原识别与清除、细胞黏附、信号传递和内吞作用等进行控制和调节^[3]。

1.1.2 糖基化简介

蛋白质糖基化的类型可以根据与糖蛋白连接方式的不同，分为N-连接糖（N-linked glycosylation）、O-连接糖（O-linked glycosylation）、糖基磷脂酰肌醇锚（GPI 锚）（ glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins）、蛋白聚糖以及 O-连接的N-乙酰葡萄糖胺（O-GlcNAc）^[1]。