1.背景材料

多环芳烃(Polycyclic aromaric drocarbons ,PAHs)是指由两个或两个以上的苯环稠合在一起的一类持久性有机污染物，主要源于石油、煤等化石燃料以及木材、天然气、秸秆等有机物的不完全燃烧或者在还原条件下经热分解而生成，其在环境中普遍存在^[1]。PAHs具有高毒性、热稳定性、生物富集性、疏水性、不易降解等特点^[2-3]，极易在环境中累积，并可通过食物链传递而在生物体内富集，对人类健康和生态环境具有很大的危害性^[4] 。

萘是多环芳烃的代表性化合物，是工业上最重要的双环芳香烃化合物，广泛应用于制药行业中。萘能引起人和动物的血液成份的变化，肝转氨酶活性升高，严重威胁人体健康，抑制水生生物呼吸，致水生生物萎缩死亡^[5] 。

随着石油化学工业的发展，萘的需要量显著增多，已成为石化工业的八大原料之一，广泛应用于塑料、石油、化工、煤加工、纺织和制药等行业中，在这些行业的生产废水中都可以检测到萘。世界上许多水体，包括湖泊甚至地下水中也都有萘的存在；萘还分布于受石油污染的海港、土壤、垃圾集散和处理场，是一类广泛存在于环境中的有机污染物。由此可知，只要在工业发展地带就会伴随着各种污染，在油田、焦化厂等地附近的土壤萘污染最为明显，这些被萘污染的土壤直接或间接危害着生态环境和人类健康。因此环境工作者不遗余力地寻找、研究消除土壤萘污染的修复技术。

2.萘污染土地的修复现状

目前常见的萘污染土壤的修复技术主要有化学修复、物理修复和生物修复，下面逐一介绍。

2.1化学修复

化学修复主要采用的方法是化学淋洗法(Soilwashing）。土壤的化学淋洗技术首先用冲洗助剂或水这些含有某些能够促进土壤中污染物的溶解或迁移的物质投放到被污染的土壤中，然后污染物就会跟随液体从土壤中提取出来，并做进一些后续处理的过程。影响土壤的化学淋洗技术的因素主要有以下几个:

(1)土壤中污染物的不同类型及其存在状态

(2)污染物与上壤结合的方式不同，可能通过物理作用与土壤结合，或以一种微溶的固体形态吸附于或者覆盖于土壤颗粒表层，也可能通过化学键与土壤颗粒结合附一着于土壤表面。土壤内多种污染物的相互作用也能够影响洗淋效果。

(3)土壤质地特征：土壤淋洗法对粘质土/壤质土含量20%-30%以上的土壤处理效果不是很好，在某些土壤的淋洗经验中，需要用一些方法减小土壤颗粒，避免淋洗液和污染物在淋洗土壤的过程中大面积扩散。

淋洗法能够高效去除土壤中的污染物并能够在一定程度上防止有害污染物的扩散，而且具有安全、经济等优点。但这种方法仅适用于砂壤等渗透系数比较大的土壤，对渗透性差、粘性大的土壤修复效果不是很明显，且在土壤和地下水中会因残留的污染物而存在二次污染^[6]。

2.2物理修复

物理修复的内容主要用客土法和换土法将土壤中的萘污染物去除。

客土法的过程是把没有污染历史的土壤覆盖在受污染的土壤区域，使污染物的浓度降低到规定的临界毒性浓度以内，或者减少土壤中植物根系接触污染物的机会，从而达到降低危害的目的。

换土法是用没有污染历史的土壤取代或部分取代被污染的土壤，以减小土壤中污染物的浓度、增加土壤的环境容量为出发点，以达到修复被污染土壤的目的的处理方法^[7]。换土法主要包括四种处理方法，分别是换土、翻土、去表土和客土。换土就是移走受污染的土壤，换上没有污染历史的土壤，这个方法适用于被难分解且易扩散污染物污染的土壤、小面积污染严重的土壤和被放射性污染物污染的土壤，这个方法的注意事项是对换出的污染土壤做严格处理以免二次污染。翻土是将新鲜土壤翻到被污染的土壤的表层，让聚积吸附的污染物分散到更深的土壤层次以达到分散稀释的目的，同时利用氧化作用和光的分解作用，使易挥发、易分解的小分子量有机污染物得以消失，此方法对于土层深厚的土壤比较适用。去表土是直接移除受污染的土壤以达到净化土壤的目的^[8]。换土法能够有效的隔离受污染土壤与生态系统以减少对生态系统的破坏和影响。但这种方法耗用费用高、工程量较大只能适用于土壤受污染严重的小面积的情况，但是不能彻底将污染物去除。

2.3生物修复

生物修复(Bioremediation)是指利用微生物的代谢活动将地下水、土壤、海洋等环境中的有毒害的污染物利用，将其变成无害物质或者最终完全降解为二氧化碳和水的过程^[9]。

生物修复归根到底是利用土壤、植物、微生物组成的组合体系来将环境中的污染物降解的一种途径。它利用太阳能为动力的”水泵”以及相关的”植物反应器””土壤过滤器””微生物净化器#8217;”，所以该系统可以称得上是一个强大的”生态活净化器”^[10]。生物修复被污染土壤主要有以下5个机理:生物挥发、生物固定、生物转化或降解、生物提取(植物积累)、植物根际间微生物群的降解作用。

目前，无论是从研究规模、研究深度还是重视程度上，与大气、水体污染方面的研究相比，有关萘污染土壤的研究工作都存在较大差距。20世纪90年代以后，萘污染的程度越来越严重，给人类生活带来了伤害，所以被萘污染土壤治理的研究引起了世界各国的广泛重视。与传统的物理法、化学法相比，生物学修复方法具有经济效益好、无二次污染、安全等优点，因此污染土壤中萘的生物降解被公认为是最有效、最具前景的一项污染治理技术^[11-13]。

3.萘的生物降解

3.1降解萘的微生物种类

自1972年以来人们己经发现能够降解萘的菌种涉及到假单胞菌((Pseudanonas)、红球菌(Rhodoaoccus)、微球菌(Miciocccus)、产碱菌(Alcalgenes)、棒状杆菌(Corynebacteria)以及真菌和藻类等。1984年，高才昌等报道了铜绿假单胞菌ASI 860具有降解萘的能力，同年，赵姬勇等又分离纯化出了一株具有降解萘能力的假单胞菌((Psecnonas sp. ) S13。 在接下来的几年里吴云^[14]、王岳五^[15]和蔡宝立^[16]等分别于1992年、1994年和1998年发现了短芽抱杆菌(Bacillubrewis) J74,铜绿假单胞菌PIC-N、黄杆菌(Flavobacerium)ND3三株菌株均具有降解萘的能力。

到目前为止人们报道分离的已知的萘降解细菌有Mycobacterium sp.,Alcaligenes denitrificans，Pseudomonas putida，P. vesicularis，P. fluorescens，P. Paucimobilis, P. cepacia，P. testosterone , Rhodococcus sp.,Bacillus cereus Corynebacterium venale,Moraxella sp.，Cyclotrophicus sp.，Yibrio sp.和Streptomyces sp.。

3.2萘的生物降解途径

萘的生物降解主要有儿茶酚间位裂解途径、儿茶酚邻位裂解途径和龙胆酸途径三种途径，儿茶酚降解途径的主要代表菌株是Pseudanonas龙胆酸降解途径的主要代表菌是Ralstonin U2。下而是以下这三种降解途径：

儿茶酚间位裂解途径:上游操纵子(na hAAa bACa dBF 2CED)编码的酶将萘氧化成水杨酸，下游操纵子(nahG Th INLOMKJ)编码的酶将水杨酸降解成可进入三梭酸循环的小分子物质。水杨酸经由nahG基因编码的水杨酸轻化酶催化形成儿茶酚，儿茶酚再经过由nahH基因编码的儿茶酚2, 3-双加氧酶催化后其间位的环打开形成可进入三梭酸的小分子物质。

茶酚邻位裂解途径:该途径与儿茶酚间位裂解途径基本相同，不同之处就在于儿茶酚是通过1, 2-加氧酶的催化在其邻位上开环形成可进入三梭酸循环的小分子物质。

龙胆酸途径:该途径从萘到水杨酸的降解与前两种途径相同，水杨酸以后的降解步骤就不尽相同了，首先是由水杨酸-5轻化酶( nagGH基因编码、催化水杨酸轻基化反应生成胆酸然后由龙胆酸途径的酶( nagKL基因编码)催化龙胆酸氧化，使其进一步降解^[8]。

3.3表面活性剂在生物降解萘上的应用

将表而活性剂应用于萘的降解可以有效的提高萘的降解率，其中包括合成的表而活性剂和微生物分泌的表而活性剂两种。前者是通过形成微胶囊的形式明显的增加了萘的溶解度和溶解速率，增加了菌体、萘和表而活性剂之间的相互作用，从而大大提高了萘的降解率。后者是形成多分子结构，生物表而活性剂的疏水基团分散在整个分子的表而，减少了表而张力和临界浓度，从而提高萘的降解率。在此方而的研究主要是外国研究者们进行并取得了一定的成功，我国除了LU等^[17]在1995年研究了两种合成的表而活性剂Brij30和T ritonX-100对萘降解的影响以外没有人再进行过研究。国外以下的研究成果很有意义。

1994年，Andrea对几种合成的表而活性剂对多环芳烃的降解进行了研究，研究结果表明十二烷基硫酸钠会抑制多环芳烃的降解而非离子表而活性剂中聚氧乙烯月桂醚类的表而活性剂对降解菌具有毒害作用;烷基酚聚氧乙烯醚类表而活性剂可以提高一些芳香烃的降解率。

1995年，Frank等^[18]对Triton X-100, Tetgitol NPXBrij35和IgepalCA-7205种表而活性剂进行了研究，发现不仅明显的提高了萘的溶解能力也提高了萘的溶解率。

1998年，Vo keting等^[19]在对土壤中多环芳烃的降解进行研究时就发现表而活性剂就有提高污染物从土壤中溶解到水相的作用，其主要机制包括乳化作用、形成微胶囊结构和易化运输3种形式。

2008年，San等^[20]将一种新型的以聚己酸内酯为中心的表而活性剂用于了少动鞘脂单胞菌(Sphinganonas paucinobilis)和由铜绿假单胞菌(Planonas auregilos )、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis),淀粉液化芽抱杆菌(Bacilhs amybliqueficiens)及巨大芽抱杆菌(Bacillus mesa tetiun)组成的混合菌生物降解水体中萘的研究上，实验结果表明无论用什么菌株，此种表而活性剂都可以大大提高萘的降解率，且其效果要好于十二烷基硫酸钠(SDS)。

4.课题的提出及研究意义

随着社会工业化的不断发展，世界各地的土壤都受到不同程度的污染，世界十大骇人听闻的环境污染事件己给人们敲响了警钟，人们的环保意识逐渐增强，保护环境，保护我们赖以生存的土地资源己迫在眉睫。萘因其对环境对生物体突出的危害性而受到越来越多的关注，然而目前对萘的生物降解却鲜有报道，另外由于土壤成分的多样性，在污染土壤中处理萘降解菌存在很多需要解决的问题。基于此，本课题通过对污染土壤中的菌株进行驯化、筛选、分离，筛选出能够降解萘的菌株，并对其进行生物鉴定和降解特性以及降解机理研究，为研制新型、高效的萘生化处理技术提供理论与实践依据，也为生物降解多环芳烃提供理论基础。

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研究的问题： 1.从被石油污染的土壤中富集、驯化并筛选可以降解萘的菌株；

2.选取降解率较高的菌株，初步鉴定所筛选的菌株；

3.对菌株降解萘过程中的培养条件进行优化，提高菌株对萘的降解率；

4.所筛选萘降解菌的降解特性的研究；

5.所筛选萘降解菌株降解途径和机理的分析研究。

研究手段：1.通过合适的培养基进行菌株的富集、驯化和筛选；

2.通过萘降解菌的形态学、生理生化实验和16SrDNA分析等对菌株进行初步鉴定

3.从分离获得的萘降解菌作为研究对象，研究其底物利用广谱性，并探究环境因子(盐度、pH)和营养添加物对其降解萘的影响；

4.以筛选所得菌株为研究对象，采用HPLC分离出该菌在降解萘过程中生成的中间产物，并采用GC-MS进行测定分析，探究该菌株的萘降解途径，深入探究萘降解机制。