1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写

2000字左右的文献综述：

文 献 综 述

1.基于斑马鱼模型的水飞蓟素毒理学评价概述：

1.1水飞蓟素简介：

水飞蓟素（silymarin）是从一种名为乳蓟（Milk Thistle）植物提炼而成，其结构式如图1所示，主要含有水飞蓟宾(silybin)、水飞蓟亭(silychristin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟宁(silydianin)，其中水飞蓟宾的含量最高[1];具现代药理学研究，该化合物有保肝护肝、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等多种生理学活性[2-5][14-15]。关于水飞蓟素的药理活性与临床评价研究文章很多[6],但研究其毒理学特性的评价甚少。

1990年Lotteron等人报道了在小鼠肝微粒体内，水飞蓟素能减少由CCl4代谢物引起的体外脂质过氧化及有还原型辅酶II（NADPH）单独引起的过氧化作用[14],表明水飞蓟素为链中断抗氧化剂或为自由基清除剂。Jiang C等[16]亦报道，水飞蓟素可减少血管内皮细胞生长因子，并使内皮细胞明显凋亡，内皮细胞的毛细血管状化形成能力被明显抑制；实体瘤的生长依赖血管持续和广泛生成，血管同时又是肿瘤发生转移的主要途径，抑制血管生成已经成为治疗肿瘤的一个重要手段。

Huang等[16]采用小鼠急性经口毒性试验、Ames试验、骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、90d喂养试验对水飞蓟素的安全性毒理学进行研究，实验表明在小鼠体内未见明显毒副作用。

图1：水飞蓟素的分子结构

1.2斑马鱼模型

1.2.1斑马鱼胚胎发育技术在毒性评价中的应用

利用斑马鱼胚胎来研究水溶性污染物的毒理效应是当今最常用的方法之一。不少学者认为生命的胚胎期对外源化学物质是最敏感的[18]。利用斑马鱼成鱼来研究化学物质的急性毒理及其副作用的文章比较少,这些研究的有毒物质包括铅和铀[19]、马拉硫磷[20]、灭滴灵[21]、氨基苯[22]、秋水仙素[23]等。现在越来越多的研究方法是利用斑马鱼胚胎暴露于梯度浓度的某种毒理物质一直到其幼鱼阶段,从而评价其毒理学终点。

斑马鱼是常见的暖水性(21-32e)观赏鱼，鲤科，成年鱼个体小(4-5cm),常年产卵，卵仔体外受精、发育，对母体无任何影响；从受精卵发育成胚胎只需24h。由于胚胎完全透明，可视性好，即使发育在高级阶段，任然可以观察到全部细胞，荧光染色可使细胞器观察的清清楚楚[7]。不仅可以观察到每个细胞的发育过程，也可以观察到原肠期细胞运动、脑区形成和心跳等胚胎发育情况[8]，同时也很容易检测出发育过程中异常的突变体[9]。现在已经成功的发展了斑马鱼的突变技术，毒理学研究奠定了基础。

Goran Dave[31-32]于1986-1990年间测定HgCl2、Pb(CH3COO)2#183;3H2O、CuCl2#183;5H2O、NiSO4#183;6H2O、 K2Cr2O7、Zn2SO4#183;7H2O和CoCl#183;6H2O在标准条件下（重蒸水的硬度为100mg/LCaCO3,pH=7.15-7.17）的斑马鱼胚胎和幼鱼的毒性。从囊胚阶段（产卵2-4h）开始染毒，每日观察化合物对孵化和存活的影响，持续观察16d，与Co、Pb、Hg、Zn、Cr相比，Cu和Ni是特定孵化抑制剂。

Schulte等[17]的试验，选用24孔细胞培养板作为染毒试验容器，倒置显微镜观察。胚胎发育至浮华的71h内可以观察到近20种不同的反映指标[18](表1)，其中N类指标代表致死性，O类指标揭示化合物特定的作用方式（非致死性指标）。某些指标症状是某种基因突变的表现。

表1：观察的毒理学终点和不同类型指标

1.2.2斑马鱼仔鱼在毒性评价中的应用

斑马鱼(Zebrafish)是脊椎动物，它的血液、心血管、消化道、肾脏、肝脏以 及视觉系统与人类有相似之处。斑马鱼基因与人类基因同源，大约70％，部分斑马鱼蛋白序列，也显示超过70％的同源性与人类相应的蛋白质[24-25]。 它的胎心与人胚胎时的心脏类似，有心房心室，心房之间有瓣膜。斑马鱼特别适合心血管系统的研究，因为在活的鱼卵中，用肉眼能清楚的看见心脏形态和功能的缺陷，较细微的差别可用分子标记物来识别。而且斑马鱼仔鱼早期生存不依赖血液循环[10],这为观察心血管系统异常发育过程提供了一个极好的模型。

20世纪90年代初，斑马鱼开始被用于混合化学物的检测[27]及其中一种化学物相对其他化学物的生物积累效应的研究[28]。环境毒物的慢性生物学效应鉴定可使用斑马鱼的整个生命周期试验以检测死亡率、生长抑制情况、生殖毒性以及发育毒性和神经行为毒性[29]。

近年来，低级脊椎动物#8212;斑马鱼，越来越多地运用于生殖发育毒性、神经毒性、致癌毒性、内分泌毒性的多方面的研究[11-13]。对同一时期的斑马鱼仔鱼进行分浓度梯度投毒喂养，经一段时间后，用荧光染色对仔鱼的肝等器官进行标记，通过测量荧光强度不同[14-15],间接反映肝脏等器官发育的程度是否完全。

Sumanas等[30]在近期综述了斑马鱼可作为检测药物靶器官的有效模型。

Fan Zhang等[26]研究头孢他啶在发育时期的斑马鱼中表现的毒性特征，在暴露于各种药物浓度后观察两个发育期的斑马鱼三天。在不超过10 mg / mL的剂量下，头孢他啶对6-hpf斑马鱼胚胎无毒。在15mg / mL的剂量下胚胎出现异常，在40mg / mL时增加至70％（图2A）。 致畸性表现为异常腹部，轻度血液汇集和充血、脊柱弯曲，短体。 在孵化阶段去除药物后，部分恢复异常表型。 随着投入头孢他啶浓度的不同，致死率与畸形率存在差异（图2B）。

图2头孢他啶的斑马鱼胚胎毒性评价

2、研究方法

将野生型斑马鱼根据Westerfield方法养殖，并收集受精卵于28.5℃恒温水浴箱中控光培养。选取发育至4hpf的健康胚胎，至于不同浓度的水飞蓟素培养液中，进行斑马鱼胚胎毒性试验[33]，观察24hpf观察胚胎卵凝结，48hpf记录胚胎心率，72hpf记录其孵化情况，在96hpf观察胚胎自主活动、心脏、卵黄囊、体轴等部位的畸形，并统计每组的畸形率、死亡率。选取发育至5dpf的健康幼鱼，每天定时定量对各个实验组斑马鱼投放不同浓度的水飞蓟素，进行斑马鱼仔毒理学实验[34]，观察其生存率和死亡时间，解刨其尸体观察肺、脑、心、脊柱、尾部等变化。

3、研究目的及意义：

斑马鱼作为毒理学评价工具已被广泛认可和使用。本课题旨在基于斑马鱼为模型，对水飞蓟素的胚胎发育毒性以及其他毒理学特性进行评价，为水飞蓟素的广泛应用提供毒理学方面的支持。

参考文献：

[1] Egawa N, Kawai K, Egawa K, et al. Molecular cloning and characterization of a novel human papillpmavirus, HPV 126, isolated from a flat wart-like lesion with intracytoplasmic inclusion bodies and a peculiar distribution of Ki-67 and p53[J]. Virology, 2012, 422(1):99-104.

[2] 阳月娥.716例妇科宫颈疾病患者HPV检测结果分析[J].实用预防医学,2013, 20(8):992-993.

[3] De Villiers EM, Fauquet C, Broker TR, et al. Classification of papillomaviruses[J]. Virology, 2004, 324(1):17-27.

[4] Holmes EC. The phylogeography of human viruses[J]. Mol Ecol,2004,13(4):745-756.

[5] 井明霞,陈继明,郭晓婷,等.人类乳头瘤病毒(HPV)的检测方法[J].现代预防医学,2007,22(12):4270-4271.

[6] WellingtonK, JarviB. Silymarina review of it solinical propertiesin the management of hepaticdisordersBio Drug, 2001, 15(7):465.

[7] Cooper MS, D#8217;Amico LA, Henry CA. Analyzing morphogenetic cell behaviors in vitally stained zabrafish embryos.Methods Mol Biol, 1999, 122:185-204.

[8] Wilson ET, Helde KA, Grunwald DJ.Something#8217;s fishy here-rethinking cell movements and cell fate in the zabrafish embryo. Trends in Genetics, 1993, 9(10):348-352.

[9] Helde KA, Wilson ET, Cretekos CJ, et al. Contribution of early cells to the fate map of the zabrafish gastrula. Science, 1994, 265(5171):517-520.

[10] Sehnert AJ, Huq A, Weinstein BM,et al. Cardiac contractility. Nat Genet, 2002, 31(1):106-110.

[11] Kari G, Rodeck U, Dicker A. Zebrafish:an emerging model system for human disease and drug discovery[J]. Clin Pharmacol Ther, 2007, 82:70-80.

[12] CRISTINA S, ZON L I. Hooked Modeling human disease in zabrafish[J]. Journal of Clinical Investigation, 2012, 122(7):2377-2343.

[13] DAI Y J, JIA Y F, CHEN N, et al.Zebrafish as a model system to study toxicology[J].Environmental Toxicology amp; Chemistry, 2014, 33(1):11-17.

[14] Letteron P, et al. Biochem Pharmaol, 1990,39:2027.

[15] Alarcon L, et al. J Pharm Phamacol, 1996, 48:968.

[16]黄凰, 张莹莹, 胡余明,等. 水飞蓟提取物的急性毒性、遗传毒性和亚慢性毒性研究[J]. 实用预防医学, 2016, 23(1):103-105.

[17] Schulte C, Nagel R. 1994. Test acult toxicity in the embryo of zabrafish, Brachydanio rerio, as an alternative to the acute fish test:Preliminary results.ATLA,22:22-19.

[18]Eaton JG, M cK in JM, Holcom be GW. Metal toxicity to embryos and flarvae of seven freshwater fish species--I Cadm ium Bull Environ Contam Toxicol 1978, 19(1):95-13.

[19] Labrot F, Narbonne JF, Vill P, et al Acute toxicity, toxicokineticsf and tissue target of lead and uranium in the clam Corbicala fluminea and thw worm Eisenia fetida comparison with the fish Brachvdanio rerio Arch Environ Contam Toxicol,1999,36(2):167-178.

[20]Kunar K, AnsariBA. Malathion toxicity effect on the liver of the fishf Bradydaniorerio. Ecotoxicol Environ Saf,1986,12(3):199-205.

[21] Lanzky PF , Halling-Sorensen B The toxic effect of the antibioticm et ronidazole on aquatic organisms Chemosphere.1997,35(11):255-361.

[22] Zok S Gorge G, Kalsch W,et al Bioconcentration, metabolism andf toxicity of substituted anilines in the zebrafish.SciTotalEnviron 1991,109-110:411-21f.

[23] Roche H, Boge G, Peres G. Acute and chronic toxicities of colchicine in Brachydanio rerio Bull Environ Contam Toxicol,1994,52(1):69-73.

[24] Howe K, Clark MD, Torroja CF, Torrance J, Berthelot C, Muffato M. et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 2013; 496: 498#8211;503.

[25] Soraya S, Eduardo PR, Javier SB. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease.Am J Neurodegener Dis. 2013; 1: 32#8211;48.

[26] Zhang F, Qin W, Zhang JP, et al.Antibiotic toxicity and absorption in zebrafish using liquid chromatography-tandem mass spetrometry.[J]Plos One,2015,10(5):e0124805

[27]Ensenbach U amp; Nagel R. Toxicity of complex chemical mixtures:acute and long-term efffects on different life stages of zebrafish[J]. Ecotoxicol Env Saf,1995,30:151-157.

[28] Ribeyre F, Amiard-Triquet C, Boudou A, et al. Experimental study of interactions between five trace element-Cu,Ag,Se,Zn,Hg,toward their bioaccumulation by fish from the direct route[J]. Ecotoxicol Env Saf,1995,32:1-11.

[29]Ohan NW, Heikkila J. Reverse transcription overview of the technique and its applications[J].J Biotech Adv,1993,11:13-29.

[30] Sumanas S amp; Lin S. Zebrafish as a model system for drug target screening and validation[J].TARGETS,2004,3,(3).

[31]Dave G, Xin R Q.1991.Toxicity of mercury,copper,nickel,lead,and cobalt to embryo and larval of zebrafish.Arch Envir on Contam Toxicol,21:126-134.

[32] Dave G.1987.Ring test of an embryo larval toxicity test with zabrafish using chromium and zinc as toxicant.Environ Toxicol Chem,6:61-71.

[33]蒙怡, 刘华钢, 梁瑜,等. 氯化两面针碱对斑马鱼胚胎毒性的研究[J]. 毒理学杂志, 2012(5):368-371.

[34]戴文聪, 刘莉, 王坤元,等. 急性酒精性脂肪肝斑马鱼模型的建立[J]. 临床肝胆病杂志, 2013, 29(4):286-289.

２．本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段（途径）：

解决的问题：

本课题要求观察水飞蓟素对斑马鱼胚胎发育的致死率和致畸率，和对成熟的斑马 鱼 器官的解剖观察及致死量观察，通过数据分析后，对水飞蓟素进行的毒理评价。

研究手段：

本研究通过运用胚胎及成鱼给药、半数致死量评价、显微观察、畸形判定、以及分子生物学技术检测特异靶器官与毒理相关基因的表达以及统计学分析等方法，对水飞蓟素在斑马鱼水平的毒性给予评价。 将野生型斑马鱼根据Westerfield方法养殖，并收集受精卵于28.5℃恒温水浴箱中控光培养。选取发育至4hpf的健康胚胎，至于不同浓度的水飞蓟素培养液中，进行斑马鱼胚胎毒性试验,观察24hpf观察胚胎卵凝结，48hpf记录胚胎心率，72hpf记录其孵化情况，在96hpf观察胚胎自主活动、心脏、卵黄囊、体轴等部位的畸形，并统计每组的畸形率、死亡率。选取发育至5dpf的健康幼鱼，每天定时定量对各个实验组斑马鱼投放不同浓度的水飞蓟素，进行斑马鱼仔毒理学实验，观察其生存率和死亡时间，解刨其尸体观察肺、脑、心、脊柱、尾部等变化。

课题工作内容：

首先利用胚胎技术将水飞蓟素加入胚胎培养液中，分时段观察胚胎发育的现象；其次对成熟的斑马鱼进行投放培养，分时段观察成熟斑马鱼的现象；进一步对实验中的现象和数据进行分析处理，并对某些靶器官基因进行检测，总结水飞蓟素对斑马鱼的毒性。