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基于摄影测量技术和图像处理技术

测量叶片长度和玫瑰花结面积

摘要

植物表现型是了解基因型和环境对性状表达的核心，是加快植物育种的关键因素。以前，植物表现型特征是通过侵略性的、耗时的、劳动密集的、成本不高的、通常是破坏性的人工取样方法来定量的，这些方法也容易导致观察者出现错误。近年来，摄影测量技术和图像处理技术已被引入植物表现型研究，但在大规模的植物表现型研究中结合这两种技术仍然存在着成本和效率的问题。在基础植物生物学研究和农业中应用这些高通量技术仍然处于发展阶段，但这些技术显示出快速显型的巨大前景，这将对作物改良工作和技术提供实质性的帮助。

在这项研究中，我们介绍了一个自动化的高通量显型管道，这个高通量显型管道使用了合适的成像系统和图像处理算法来构建二维镶嵌正射影像。在二维图像中，基于室内和地面的情况现场测量表现型特征，如叶长和玫瑰花结面积。我们的自动化管道具有跨平台功能并且有一定程度的仪器独立性，所以其适合各种情况。

第1章 介绍

全球的农作物生产和植物生物学研究都面临着巨大的挑战，因为到2050年，当前的作物产量将无法满足世界人口的需求（Bongaarts, 2014）。先前的研究（Furbank et al., 2009; Reynolds et al., 2009; Tester and Langridge, 2010）表明，传统的育种计划不能有效地提高水稻、玉米和小麦这三种主要谷类作物的年产量。但在过去的十年中，随着遗传技术的进步，如下一代DNA测序等技术的出现，为改进植物育种提供了新的方法。有了这些新技术，科学家可以通过分子育种来提高遗传改良率（Phillips, 2010）。

许多分子遗传学研究都集中在拟南芥上这种植物上，这些研究已经形成了一种重要的模式系统，并且已被用于识别植物基因和确定其功能（Arabidopsis Genome Initiative, 2000）。这些研究已经阐明了植物的发育过程和途径，这些过程和途径通常可以促进不同作物物种的产量。O#39;malley和Ecker（2010）的报告说明了在拟南芥中可获得纯合的同型基因组株系。Weigel和Mott（2009）Weigel和Mott（2009）生成了1001个拟南芥种质的序列数据库，使产量的比较基因组分析成为可能。同样，由于过去几年测序成本大幅降低，许多作物（如水稻、玉米、小麦、高粱和大麦）的基因组序列也已被获得（Furbank and Tester, 2011）。由于高通量的基因分型，有可能为植物育种开发大量的绘图种群和多样性小组（McMullen et al., 2009）。

遗憾的是，与提供快速且廉价的基因组信息提取的高通量基因分型相比，传统的植物表现型分析方法仍然是劳动密集型和成本不高的。这大大限制了我们将基因定量地与植物生长、环境适应和产量联系起来的能力。小型植物的植物表现型分析方法，如拟南芥，是主要依赖于强度大的手工操作，包括植物的采样、处理和测量。虽然这样的手工操作不是完全具有破坏性，但通常还是具有一定的侵略性的。由于这一耗时的过程，所以在植物整个生长期内几乎无法获取表现型的测量结果（(Arvidsson et al., 2011）。

在过去的几年中，人们对研究受控室内环境中的高通量表现型分析方法越来越感兴趣（Fiorani and Schurr, 2013）。这些将功能基因组学、现象学和植物育种联系起来的新方法不仅可以提高作物产量和作物产量稳定性，同时能有效筛选高产/耐应激品种（Bolon et al., 2011）。Walter et al.（2007）Jansen et al.（2009）使用生长屏/荧光系统测量叶绿素和叶片数量。Granier et al.（2006）利用phenopsis系统自动控制土壤含水量，以筛选土壤缺水反应。许多研究（Furbank and Tester, 2011; Dornbusch et al., 2012; Green et al., 2012; Chen et al., 2014;Dornbusch et al., 2014）都使用Lemnatec扫描分析仪的HTS系统（http://www.lemnatec.com）提取了植物的某些表现型，该系统通过使用成像激光系统扫描植物表面来获取和分析植物图像，或用于提取某些表现型特征3D点云。扫描分析仪HTS系统的主要优点是它是一个全自动的处理系统，包含图像采集、存储、管理和处理组件，以及能对结果数据进行一些后续统计分析。

在Monsanto 和 Dupont等私营企业的温室或生长室以及一些先进的国家植物研究机构（如澳大利亚植物现象研究所、欧洲植物表现型网络）以及美国农业部也部署了一些规模更大、全自动化的高通量表现型特征分析设施。在这些装置中，机器人技术、精确的环境控制和遥感技术被用来监测和评估植物的生长和发展。然而，这种高端设施需要的预算远远超出大多数研究实验室的预算，可能不适用于所有情况，如现场环境。

迄今为止，现场表型分析方法主要集中使用在集成了车辆，机器人，成像系统和传感器的平台上进行数据采集的自动化解决方案。尽管这种情况正在发生变化，但针对自动化数据存储、处理和分析的工作却越来越少。由于这些考虑和限制，现场条件下的高通量表现型分析尚未充分发挥其全部的潜力。

以前，许多室内和现场研究都是使用成像系统（照相机或扫描仪）和侵入性采样方法（切除植物部分）来提取表现型特征的（Candela et al., 1999; Peacute;rez-Peacute;rez et al., 2002; Cookson et al., 2007; Bylesjouml; et al.,2008; Ali et al., 2012; Chitwood et al., 2012）。然而，这些研究并未考虑成像系统透镜产生的光学畸变和视角产生的透视畸变等问题。如果存在光学畸变或透视畸变，则无法从二维图像确定真实距离和区域，并且仅直接面向成像系统是不能解决此问题的。特别是，当植物排列密集时，大量朝向角落的植物将被广角镜头的透视视角所扭曲（如图1.1）。因此，在从二维图像测量任何几何量之前，必须去除成像系统中的光学畸变和透视畸变。

图1.1 具有光学畸变和透视畸变的原始图像。室内环境的原始图像，显示植物在光学畸变和透视畸变校正前的状态。角落的植物严重扭曲，真实的距离和面积无法直接从图像测量。

本研究的目的是：

（1）提出一种适用于受控和现场环境的低成本、全自动、基于高通量成像的表现型系统；

（2）开发新的图像处理算法，用于测量叶长和二维玫瑰花结面积；

（3）建立玫瑰花结面积与叶长的关系模型。

第2章 材料和方法

2.1成像系统的特点和设计

与其他现有系统相比，本文介绍的系统具有三个优势：

（1）低成本成像系统；

（2）仪器独立性要素；

（3）跨平台能力。

第一个优势是现成的低成本数码相机被用作成像设备。这项技术允许直接从图像中提取和测量表现型特征（例如叶长、玫瑰花结面积、植物的感性运动和植物植被状况）。

该系统的第二个优势是具有一定程度的仪器独立性。例如，高级脚本用于与相机制造商提供的图像处理软件连接。因为许多相机制造商提供了类似的工具，所以更换相机主要是改变这些接口脚本的问题。同时，图像分析算法也可以根据不同时间传感器的图像特征进行修改。例如，我们在移动平台上成功地将多光谱图像传感器集成到我们的系统中，并对计算植被指数进行了适当的修改。

第三个优势是具有跨平台能力。尽管图像数据采集和数据传输方法在不同的应用中可能有所不同，但该系统具有通用结构，因此可以在多个环境中的不同表现型分析平台上以最小的修改进行部署。具体来说，该系统部署在两个不同的成像平台上：固定生长室平台和移动场平台。下一步将概述新的、通用的特性，使系统能够在各种各不相同的环境中运行。

如图2.1的流程图所示，系统包含五个部分。（1）图像数据采集在室内和现场环境中使用不同的平台来收集植物发展的时间序列图像。在加利福尼亚大学戴维斯分校（UCD）的生长室中，室内固定成像系统被设计并安装在六个架子上。在怀俄明大学（UWY），开发了一种用于该领域的移动成像系统。（2）图像数据的存储，传输和管理涉及使用UCD，UWY，iPlant Collaborative（http://www.iplantcollaborative.org/）和堪萨斯州立大学（KSU）的服务器。对于室内和现场实验，图像存储在本地，然后通过iplant传输到ksu。这就能得到所有映像集的三个完整备份：一个在原点，一个在iplant，一个在ksu。（3）图像处理操作包括预处理、正射影像生成和图像分割。（4）元数据协调是必要的，因为不同来源生成的元数据（即人工输入的数据和某些自动获取的数据）可能影响每个图像的标识。同时协调产生最准确的基因型和表现型数据进行配对。（5）表现型性状的提取包括产生包含系统最终目标的生物数据的机器视觉操作。Python是一种高级脚本语言，用于连接和自动化系统部分。

图2.1 系统工程流量

2.2 成像平台

2.2.1 室内成像平台

该系统的开发是加州大学戴维斯分校（UC Davis）进行的一项生长室实验的一部分，该实验研究在拟南芥作为轮回亲本的8个重组自交系（RIL）种群中的遮荫避免反应。共有108台佳能Powershot S95相机正面朝下安装在六个架子上，其中三个架子模拟太阳，另外三个架子模拟阴影（如图2.2a和b）。在每一个架子上，18个摄像机安装在架子表面上方0.4米的2排固定摄像机框架中。每个架子在0.80times;2.13米的范围内可容纳24（三排八个）4times;4个点。总植物密度为225。

每个摄像头都被分配了一个三位数的ID，依次由机架编号（1-6）、行编号（1-2）和摄像头位置（1-9）组成。图2.2c是一幅单独的图像，显示了每个摄像头的视野（FOV）和跟踪设备旋转的颜色点系统。（颜色点系统在下面的室内基因型分配章节中进行描述。）

图2.2 室内成像平台。（a）和（b）显示每个架子上的电离室成像系统。

（c）是来自一个摄像头的单个图像。在生长期，用色点系统跟踪4times;4的罐内流动。

（为了解释本图中的颜色，读者可以参考本文的Web版本。）

所有相机均设置为手动对焦和曝光模式（F7.1、1/25s、自动白平衡），焦距为28 mm（相当于35 mm）。相邻两台摄像机的视场重叠率为50%。所有相机上都安装了修改过的定时曝光器脚本和Canon Hack开发工具包（CHDK）软件，以便在每小时开始时同时触发它们。为了防止摄像头过热，脚本在拍摄完每张图像后关闭了液晶屏。所有图像都保存为佳能CR2 RAW原始格式，以保留最大数量的几何、光谱和相机信息。

2.2.2 室外成像平台

室内使用的相同基因型的拟南芥也种植在拉勒米的UWY植物科学站的室外。植物在温室的塑料网盆中生长了几天，然后随机分块移植到田里。它们被放置在一个10厘米的网格中，有14行和6列。两台佳能EOS Rebel T3I DSLR相机，带有佳能EF20 mm f/2.8广角镜头，安装在地面以上95 cm处的可移动相机架上（图2.3）。这两个摄像头的安装角度不是像室内系统设计中那样笔直向下，而是稍微向对方倾斜，以最大化各自80%视场的重叠面积。

图2.3 室外成像平台。地面现场的成像设置。两台佳能数码单反相机以一定角度安装。两个带有灰烬的扩散器安装在侧杆上，以产生均匀的照明条件。

为了稳定性和可重复性，摄像机支架被放置在每个绘图周围的金属框架上。内框尺寸为153.0cmtimes;73.6cm。为了拍摄整个照片，首先手动将相机支架按顺序移动到六个固定位置，然后拍摄照片。这六对相机并没有完全捕捉到所有的植物，但由于相机位于山的一侧，第七个位置只能看到地块外的地面。因此，相机架旋转180度，最后拍摄了第七对照片。

两个带有灰烬的扩散器附在相机支架的对面。在成像过程中，这些最小化的相机安装阴影和环境光的影响会发生变化。每个扩散器都由一根延长电缆控制，两个摄像头都设置在手动对焦和曝光模式（F9，1/200 s，自动白平衡）。定制的相机触发器（Industrial Underground Inc.，Boulder，Co.）是为了让两台相机同时工作而制造的。

2.3 图像存储、管理和传输

2.3.1 室内图像存储、管理和传输

所有摄像头都通过USB电缆连接到本地UCD数据服务器，以便自动传输图像。Perl脚本删除了夜间图像（9:00 pm到4:00 am），并使用成像日期、时间和摄像头ID的组合重命名了白天图像文件。尽管108个摄像头都安装在横向，但摄像头内置的自动旋转功能有时会将图像旋转到纵向，从而在后续步骤中产生问题。为了解决这一问题，基于Perl的exiftool程序（http://www.sno.phy.queensu.ca/~phil/exiftool/）被集成到系统中，以自动旋转发现处于纵向的任何原始图像。每天晚上，预处理的原始图像被传送到德克萨斯大学的iplan

资料编号：[3126]