文 献 综 述

1.1. 跨膜肽的性质与应用

跨膜肽是一类能够穿透细胞膜进入细胞质甚至细胞核而不损坏细胞膜结构的小分子多肽。它的长度一般不超过30个氨基酸[1]。近几年的研究证实，跨膜肽能运载一系列具有不同生物活性的物质进入活细胞内[2, 3]，包括蛋白、多肽、核酸和寡聚核苷酸等。相比其他载体而言，跨膜肽具有高效低毒的特点。正是因为这种特殊的功能，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。

1.2. 跨膜肽的检测方法

实现跨膜肽的分析纯化的方法有毛细管电泳法、高效液相色谱法[4]、质谱法[5]、毛细管电泳质谱联用法、液相色谱质谱联用法、光谱分析法等等[6]。目前，大多数的多肽分析主要采用的是毛细管电泳法和高效液相色谱法。

1.2.1. 高效液相色谱法

高效液相色谱法(HPLC)[7]以经典的液相色谱为基础，引入气相色谱的理论与实验方法，将流动相改为高压输送，并采用高效固定相及在线检测等手段，发展而成的分析、分离方法。高效液相色谱法作为一种高效、快速的分离、分析技术，以其灵敏度高、选择性好，可分析微量组成甚至痕量样品等特点，成为医药分析领域应用最广、发展最快的现代分析技术之一，HPLC具有同时分离、分析的功能，对于体内药物分析、体内内源性物质的分析及成分复杂的中药分析尤为重要，HPLC的分离功能还广泛用于药物的纯化和制备药物合成各步反应的监控和临床治疗药物的监测。在药物分析领域，无论是合成药还是微生物发酵生产的药物或天然药物，也无论是原料药还是生物样品中的药物，高效液相色谱法都成为分离、鉴定和含量测定的首选手段。近年来，高效液相色谱法在药物研究中发挥着越来越重要的作用[8]。

例如，高效液相色谱法在蛋白质分离检测中的应用[9]中，反相高效液相色谱在混合肽的分离中，可通过对流动相的和固定相的调控来提高分离效率，包括改变样品的离子对性质、固定相上分布的功能基团、色谱柱规格以及温度、pH值等，严作廷等通过HPLC对奶牛子宫内膜洗脱样品进行分离，纯化出一个新的抗菌肽分子[10]。

在刘琳等人研究燕窝酶解产物中多肽的液相色谱质谱分析[11]实验中，针对燕窝中蛋白质糖基化程度不均一和相对分子质量范围不稳定，以及由此导致的蛋白质难以分离、分析和鉴别的问题，研究一种燕窝中蛋白质和多肽的分析方法。实验采用方法为利用分步法从燕窝中提取了蛋白质组分，采用糖苷酶和蛋白酶对蛋白质组分进行了处理，采用生物质谱技术对蛋白质降解物进行了分析，并对其中的多肽进行了序列分析。其中，该实验采用的高效液相色谱质谱联用分析条件为: ZORBAX SB-C18 色谱柱(2. 1 mm #215;150 mm，5 μm)；流动相 A-水(0. 1% TFA)，B-乙腈(0. 1% TFA)；梯度洗脱，0~7min，5%~20% B；7~50 min，20%~32% B；50~90min，32%~72% B；进样量50 μL；流速 0. 2 mL/min 。实验结果为，燕窝中的蛋白提取率为 79. 7%，采用多级质谱技术从提取蛋白质的糖苷酶和胰蛋白酶处理后的混合物中检测出20种多肽。实验表明这些多肽的序列与已有蛋白质数据库中不同种类蛋白的局部序列相似，为富含糖蛋白的动物药成分研究提供了技术参考。