文 献 综 述

脂肪酶（EC3.1.1.3）具有高选择性、高稳定性、反应条件温和、不需要辅酶等优良特性，能高效催化水解、酯化、转酯化、醇解、氨解等系列反应，广泛应用于医药、化工、食品、饲料和能源等行业 ^[1-2]。然而通常具有实际应用价值的目标化合物并不是脂肪酶的天然底物，且在有机溶剂、高温、极端pH等非天然环境下极易失活，这些不利因素极大地限制了脂肪酶在工业上的规模化应用。因此，对脂肪酶进行分子改造以强化其催化性能，为工业应用提供活性更高、稳定性更好、选择性更专一、环境耐受性更强的新酶品种，使其适应工业生产过程的要求，具有重要的实际应用价值^[3]。

固定化酶是用物理或化学方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，便于运输和贮存， 且易于控制，能反复多次使用，有利于自动化生产。脂肪酶作为酶的一种，其固定化方法与其他酶相同，大致可分为：包埋法、吸附法、共价结合法和交联法等。共价键结合法是先在载体上引进一个活泼基团，然后此活泼基团再与酶分子上的某一基团反应形成共价键的方法。该方法常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等， 其中戊二醛应用最广泛。与吸附法相比， 共价结合法的反应条件苛刻，操作复杂， 改变或破坏了部分酶的活性中心，活力回收率较低，但是酶与载体结合较牢固，酶不易脱落， 稳定性好，在固定化酶的制备方法中此法研究最为活跃和深入。

化学修饰具有廉价、周期短、实验室可行、容易创造新型的酶学性质等优点，是对包括脂肪酶在内的酶进行分子改造的一种传统的重要手段。目前常用的化学修饰技术主要有交联酶晶体、结合定点突变的特异位点选择性修饰、酶蛋白侧链功能基共价修饰、酶蛋白表面修饰、结合固定化的化学修饰等^{[4-8 ]}。但是,目前化学修饰常用的修饰剂仍然局限于以醛、酸酐、胺、脂肪酸、卤代烃等为代表的官能团种类相对单一的传统有机小分子修饰剂和以聚乙二醇（PEG）及其衍生物、多糖等为代表的大分子修饰剂，而且修饰酶的选择性、稳定性、耐有机溶剂性、催化活性等性能往往不能同时得到有效的改善以满足反应的需要，这已经成为限制脂肪酶工业应用的一个重要因素。

离子液体作为近年来新兴的一种绿色溶剂和催化剂在许多种重要的有机合成反应中体现出了明显的优势 ^[9]。离子液体可以作为一种典型的﹑可设计的带多种官能团的新型功能性有机小分子，若将其用于脂肪酶的化学修饰，或许将可能有意想不到的效果，可以满足种类繁多﹑结构各异的酶修饰改性的需要。离子液体（Ionic liquids）是指由有机正离子如烷基咪唑离子、烷基吡啶离子、季胺盐离子等和不同的负离子组成的在室温下呈液体的有机熔盐。在非水生物催化应用中，离子液体同传统的有机溶剂相比具有以下突出的优点：（1）对多种有机化合物、无机化合物以及气体均有很好的溶解性；（2）基本无蒸汽压，不可燃，有优异的化学和热稳定性，易分离溶解于其中的化合物，可以循环使用；（3）可以通过改变阴离子或阳离子来调节甚至彻底改变离子液体的性质，从而设计合成适合某种特殊反应的离子液体；（4）能够维持甚至提高酶以及微生物全细胞的催化活性、操作稳定性和立体选择性^[10] 。

Abe等^[11]通过在咪唑上引入适当的手性官能团来提高脂肪酶的性。用带有手性脯氨酸的咪唑类离子液体D-ProMe化学修饰洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶，其催化反应速率比原酶提高了58倍。

Doum#232;che等^[12,13]用含羟基的咪唑、吡咯等离子液体修饰甲酸脱氢酶，修饰酶的活性和稳定性得到了显著提升。

Rahman等^[14]研究发现来源于褶皱假丝酵母的脂肪酶经四乙胺氨基酸离子液体[N2222][his]和[N2222][asn]修饰后,催化活性比未修饰的脂肪酶高一倍,同时保持了较好地稳定性.而当使用单种官能团的PEG修饰后，较强的亲水性会很大程度上影响修饰酶的溶解性和热稳定性。

Nakashima等^[15]研究发现在各种离子液体中,用梳状PEG(多分枝的PEG衍生物)对脂肪酶进行化学修饰是一种较合理的方法，不会降低酶的活性。而使用单链的PEG作为修饰剂，溶解性和活性都比前者低。

根据他们的报道，我们打算合成侧链带有羟基官能团结构的离子液体为新型化学修饰剂，用经羰二咪唑活化后的离子液体共价修饰猪胰脂肪酶(PPL)，实现脂肪酶的化学修饰。以甘油酯的水解反应为模型，研究修饰剂的结构和修饰度与酶学性质变化的关系，并通过修饰前后的酶蛋白紫外、红外、圆二等光谱变化，初步探究酶修饰改性的分子机理。