摘 要

为了克服传统骨髓炎治疗方案中存在的缺陷，联系当前属于热点的药物输送系统，设计了温敏水凝胶给药系统。由于骨髓炎的主要致病菌是金黄色葡萄球菌，所以选择了万古霉素为模型药物。我们使用开环聚合的方法，制备出了PLGA-PEG-PLGA 载体材料，并通过调节疏水链段长度制得了具有不同相转变温度的水凝胶，并且对它的机理进行了研究。我们通过在低温下直接将万古霉素溶于聚合物溶液的方式完成药物包封，并且包封率达100%；在37℃下形成的水凝胶对药物具有缓释作用，酸性环境下药物释放较快；通过MTT实验，可知载体材料对骨髓间充质干细胞有比较好的细胞相容性，制成水凝胶能以注射的形式到达患病部位；水凝胶载万古霉素之后，杀菌效果与纯抗生素相似。由上可知，制备出的温敏水凝胶能够以注射的形式应用在骨髓炎进行局部治疗，并且有广阔前景。

关键词：温敏性；水凝胶；万古霉素；骨髓炎

Abstract

In order to overcome the deficiencies in traditional osteomyelitis treatment protocols, a temperature-sensitive hydrogel delivery system was designed in connection with the current drug delivery system that is hot. Since the main pathogen of osteomyelitis is Staphylococcus aureus, vancomycin was selected as a model drug. We used the ring-opening polymerization method to prepare a PLGA-PEG-PLGA carrier material, and prepared a hydrogel with different phase transition temperature by adjusting the length of the hydrophobic segment, and studied its mechanism. We achieved drug encapsulation by directly dissolving vancomycin in the polymer solution at low temperature, and the encapsulation efficiency reached 100%; the hydrogel formed at 37°C had a sustained release effect on the drug, and the drug was in an acidic environment. The release is faster; through MTT experiments, it is known that the carrier material has better cell compatibility for bone marrow mesenchymal stem cells, and the prepared hydrogel can reach the diseased part in the form of injection; after the hydrogel contains vancomycin, The bactericidal effect is similar to pure antibiotics. It can be seen from the above that the prepared temperature-sensitive hydrogel can be applied in the form of injection for local treatment of osteomyelitis and has broad prospects.

Keywords: temperature sensitivity; hydrogel; vancomycin; osteomyelitis

目 录

第1章绪论 1

1.1骨髓炎及其治疗现状 1

1.1.1骨髓炎 1

1.1.2骨髓炎的治疗现状 1

1.2水凝胶 1

1.3本文基本思想及主要研究内容 2

第2章温敏性水凝胶的制备及表征 4

2.1引言 4

2.2实验部分 4

2.2.1仪器与材料 4

2.2.2 PLGA-PEG-PLGA的制备 5

2.2.3PLGA-PEG-PLGA的核磁和GPC表征 6

2.2.4三嵌段共聚物胶束的制备及粒径表征 6

2.2.5共聚物的临界胶束浓度 6

2.2.6 PLGA-PEG-PLGA水凝胶的制备 7

2.2.7 PLGA-PEG-PLGA水溶液的温敏相图测试 7

2.2.8万古霉素对水凝胶温敏性的影响 7

2.2.9 水凝胶的流变性能研究 7

2.3结果与讨论 7

2.3.1 三嵌段共聚物的制备 7

2.3.2 三嵌段共聚物的表征 8

2.3.3温敏水凝胶形成机理的研究 9

2.3.4 聚合物水溶液的相变研究 11

2.3.5 聚合物水溶液的流变性质研究 13

2.4小结 13

第3章 抗菌温敏水凝胶用于治疗骨髓炎的研究 15

3.1引言 15

3.2实验部分 15

3.2.1 仪器与材料 15

3.2.2水凝胶的药物释放 16

3.2.3载体材料的体外生物相容性 17

3.2.4水凝胶的抗菌性能研究 17

3.3结果与讨论 17

3.3.1万古霉素从水凝胶中的药物释放 17

3.3.2温敏材料的细胞毒性研究 18

3.3.3载万古霉素水凝胶的抗菌性能研究 19

3.4小结 20

第4章 结论 21

参考文献 22

致谢 23

第1章绪论

1.1骨髓炎及其治疗现状

1.1.1骨髓炎

骨髓炎是一种炎症性疾病，其由细菌感染引起，并会累及骨皮质、骨膜^[1]。血源性是引发骨髓炎的重要原因，此外，外伤与手术感染同样能引发骨髓炎。翻阅文献，了解到金黄色葡萄球菌是骨髓炎比较主要的致病菌，而其他如铜绿假单胞菌也可致病^[2.3]。骨髓炎有急性与慢性之分，其中，患慢性骨髓炎的患者在发展中国家比较多，并且在发展中国家中，患慢性骨髓炎的年轻男性占比较多^[4]。骨髓炎不仅使患者承受身体上的疼痛，长期的治疗更是给患者的心理带来巨大的创伤。对此，越来越多的研究人员致力于开发一种可以有效治疗骨髓炎的途径。

1.1.2骨髓炎的治疗现状

当前具有的治疗方案通常有去除病灶和在静脉直接注射抗生素。但是，抗生素长期全身使用会有如肾毒性，耳毒性等毒副作用^[5]，含有抗生素浸渍物的局部植入，可以在病变部位提供高浓度的抗生素，并且可以很大程度上减少毒性和副作用。已经证明植入含抗生素的PMMA骨水泥是一种能有效治疗骨感染的方法。但PMMA骨水泥不能在体内降解需要通过手术将其去除。解决上述问题的关键在于制备可以在体内降解的植入物，FDA批准各种可降解聚合物如聚乳酸（PLA）^[6]和聚丙交酯乙交酯（PLGA）^[7]可以用于临床使用，并且能达到缓慢释放抗生素，在体内发挥长效抗菌作用的目的。然而这些聚合物有比较差的生物相互作用^[8]，对抗生素的包封率也无法保证，是应用于临床面临的实际问题。

近来，药物输送载体越来越成为研究热点，研究人员发现可注射温敏水凝胶制备简便，具有比较高的包封率，可以包封药物与其他生物活性分子，而且在制备时不需要有机溶剂；具有恰当的相转变，可以给患病部位足够的药物，并且可以在没有二次手术的情况下被移除；在温度较低时，封装药物与存储所得产物，可以防止其失去作用，产生不良影响。

1.2水凝胶

水凝胶一般同时具有亲水和疏水两种基团，作为高分子聚合物，其能在水中发生溶胀而不溶于水，并且能够吸收远超本身质量数的水^[9]。其中能响应外界刺激的称作智能水凝胶^[10]。常见的有以下几种：

1. pH响应型水凝胶

pH响应是指当 pH值变化时，可引起水凝胶溶胀或消胀的变化^[11]。当把少量疏水性结构单元引入到弱聚电解质中可实现pH敏感型水凝胶的响应特性，而相当于物理交联的疏水微区可以干扰由于聚电解质解离所引起的溶胀。

1. 温度响应型水凝胶

温度响应型水凝胶是指随着温度的变化而产生体积或相转变的水凝胶。当外界的温度变化时，能对此作出刺激响应性的水凝胶称为温度响应型水凝胶，温度变化，会影响该水凝胶亲疏水基团之间的疏水相互作用，也会影响链之间的氢键，进而改变该水凝胶的的网络结构，发生体积或相转变。

1. 光响应型水凝胶

光响应型水凝胶在光照条件下，其对光敏感基团的结构或性能会发生改变，其相应机理如下所示：材料中的感光分子可以将光能转变为热能，使得材料温度升高，当其达到材料的相转变温度时，凝胶会有响应；光照时，材料中的光敏分子会分解，这个过程中产生的离子化作用可以用来实现光响应^[12]。

而低温下是液状，当温度接近体温变为凝胶状的智能水凝胶则被称为可注射水凝胶^[13]。这种水凝胶引起了很大关注，当其是液状时不仅能够封装活性分子，并且不加入有机溶剂就能实现该过程，也不会影响活性分子的性质。将其注射进入人体，在体内形成凝胶，通过凝胶聚合物降解与扩散作用使得包埋物实现缓释。

1.3本文基本思想及主要研究内容

治疗骨髓炎依旧是临床医生面临的主要挑战之一，当前的治疗方案通常是去除病灶和在静脉直接注射抗生素。但是，抗生素长期全身使用会有如肾毒性，耳毒性等毒副作用，含有抗生素浸渍物的局部植入，可以在病变部位提供高浓度的抗生素，并且可以很大程度上减少毒性和副作用。已经证明植入含抗生素的PMMA骨水泥是一种能有效治疗骨感染的方法。但PMMA骨水泥不能在体内降解需要通过手术将其去除。解决上述问题的关键在于制备可以在体内降解的植入物，FDA批准各种可降解聚合物如PLA和PLGA 可以用于临床使用，并且能达到缓慢释放抗生素，在体内发挥长效抗菌作用的目的。然而这些聚合物有比较差的生物相互作用，对抗生素的包封率也无法保证，是应用于临床面临的实际问题。

近来，药物输送载体越来越成为研究热点，研究人员发现可注射温敏水凝胶制备简便，具有比较高的包封率，可以包封药物与其他生物活性分子，而且在制备时不需要有机溶剂。具有恰当的相转变，可以给患病部位足够的药物，可被分解，并且可以在没有二次手术的情况下被移除。在温度较低时，封装药物与存储所得产物，可以防止其失去作用，产生不良影响。

在传统药物制剂中，给药后短期内血药浓度会很快升高，有时会升高至中毒浓度。释药过程中的药物浓度可能会降低至比有效治疗浓度还小，甚至会失去疗效。为了解决这种问题，患者需要每天进行多次定期给药，不仅不方便，而且药物在体内的浓度会有很大波动，使得治疗效果不好。为此，研究人员开发出一种能够缓控释药物、降低给药频率并且具有较高生物利用度的药物载体输送系统。

在制备温敏水凝胶的众多材料中，适用于注射的聚丙交酯乙交酯与聚乙二醇的三嵌段共聚物（PLGA-PEG-PLGA） 水凝胶得到了研究人员的广泛关注，该聚合物具有疏水PLGA链段与亲水PEG链段，没有毒性，可被分解。而且可以通过开环聚合反应得到，操作简便易行，且过程中不涉及有机溶剂。

所以，本文的基本思想是，先用开环聚合反应制备出PLGA-PEG-PLGA聚合物，并以其为载体材料制备成可注射的温敏水凝胶，装载抗生素万古霉素，对骨髓炎进行局部治疗。

主要研究内容如下所示：

1. PLGA-PEG-PLGA的制备；
2. 负载万古霉素PLGA-PEG-PLGA水凝胶的表征；
3. 负载万古霉素PLGA-PEG-PLGA水凝胶的药物释放研究；
4. 负载万古霉素PLGA-PEG-PLGA水凝胶的抗菌性能研究。

第2章温敏性水凝胶的制备及表征

2.1引言

水凝胶一般同时具有亲水和疏水两种基团，作为高分子聚合物，其能在水中发生溶胀而不溶于水，并且能够吸收远超本身质量数倍的水，其中能响应外界刺激的称作智能水凝胶。低温下是液状，当温度接近体温变为凝胶状的智能水凝胶则被称为可注射水凝胶。这种水凝胶引起了很大关注，当其是液状时不仅能够封装活性分子，并且不加入有机溶剂就能实现该过程，也不会影响活性分子的性质。将其注射进入人体，在体内形成凝胶，通过凝胶聚合物降解与扩散作用使得包埋物实现缓释。

温度敏感型水凝胶作为可注射型材料是一种比较理想的局部缓释载体。通过改变温度，温敏材料能实现溶胶-凝胶相转变，从而实现局部释放药物、蛋白质等。骨架材料一般为高分子物质，有天然的，也有人工合成的，前者包括壳聚糖、透明质酸等，后者有聚丙烯酰胺类、PEG / 聚酯类等。近年来，具有良好安全性、适用于注射的PLGA-PEG-PLGA 三嵌段温敏水凝胶引起研究人员的广泛关注。该聚合物具有疏水PLGA链段与亲水PEG链段，没有毒性，可被分解。PLGA-PEG-PLGA共聚物可采用开环聚合的方法制备，操作简便，并且分子量可调，能运载疏水性药物和亲水性药物，在临界凝胶转变温度下是溶液状，而当温度在这之上时，转变为凝胶状，是良好的释药基质。

本章制备了共聚物PLGA-PEG-PLGA，对其结构进行验证，然后以其为材料制得水凝胶，并且研究了所得产物的形成机理、相转变以及流变性能。

2.2实验部分

2.2.1仪器与材料

2.2.1.1主要仪器

表2.1主要仪器的型号及来源

2.2.1.2实验材料

表2.2 主要材料及来源

2.2.2 PLGA-PEG-PLGA的制备

将Na和苯酮放入到苯基甲烷中，在高温下蒸发回流，待溶液变成蓝色后，将所得物蒸发出来，目的是使苯基甲烷中的多余水分消失。将醋酸酐和几滴H₂SO₄倒至醋酸乙酯中，并将混合物长时间保持沸腾，大约4h然后蒸出。将干燥纯净的K₂CO₃加入到蒸出液中，搅拌均匀，在溶液中加入磁子并将其置于磁力搅拌器上，大约8h后过滤，并蒸馏滤出液。

通过重结晶LA和GA，得到纯净的反应物质。然后分别称取一定质量的LA和GA，倒入纯净的醋酸乙酯（1g / mL，共沸混合物和浓H₂SO_4，接着蒸发，然后加入无水K₂CO₃，置于搅拌机上过夜，然后滤除杂质），升高温度，震荡下使其成溶液，然后在溶液还热时过滤，把滤纸上的物质放在冰箱里面等待其沉淀，然后反复进行干燥，得到精制LA和GA。

将PEG 1000溶于DCM中，然后加入乙醚使其沉淀并除去水分。

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