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摘 要

(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯是他汀类药物的重要手性中间体，可用于合成羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-COA)还原酶抑制剂。这类药物能够有效预防冠心病和动脉粥样硬化等疾病。生物催化(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯不对称合成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯因其经济效益和社会效益等受到越来越多的关注。

醇脱氢酶(Alcohol Dehydrogenase，简称ADH，EC1.1.1.1)是常用的生物催化剂，可以催化醇生成酮或醛及其可逆反应。来自木兰假丝酵母(Candida magnolia)中的醇脱氢酶ADH3(alcohol dehydrogenase 3,GenBank: ABB91667.1)及其突变酶AIDI对于催化合成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯具有很高的催化活性和立体选择性。AIDI是ADH3经过定点突变而来，辅酶依赖型由完全依赖NADPH改为完全依赖NADH。本文研究了突变前后的酶学性质的改变，并基于AIDI的酶学性质，建立了催化合成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯的反应体系。

游离酶催化合成(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯。在游离酶体系中，AIDI用于催化合成反应，葡萄糖脱氢酶用于NAD/NADH的高效循环利用。。随着底物浓度的增加，底物的转化率逐渐降低,从降低催化成本方面考虑，50 g/L的底物浓度最为恰当。在最适条件下，50 g/L的(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯转化12 h后，转化率能达到94%，e.e.值gt;99%。

利用醇脱氢酶催化(S)-6-氯- 5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的研究，不仅获得了高产量，高光学纯度的(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯，也为其他手性化合物的合成研究提供了理论参考，具有较大的工业应用前景。

关键词：(S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯 醇脱氢酶 生物催化

(3R，5S)-6-氯-3，5-二羟基己酸叔丁酯

Abstract

(3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate is an important chiral intermediates of statins, mainly used in the synthesis of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenayme A(HMG-CoA) reductase inhibitors.The drugs can effectively prevent the occurrence of coronary heart disease and atherosclerosis.With economic and social benefits, asymmetric reduction of tert-butyl (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxo-hexanoate to (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate has become one of the major focuses.

Alcohol dehydrogenase is a common biological catalyst, can generate catalytic alcohol ketones or aldehydes and reversible reactions.A mutant(AIDI) of alcohol dehydrogenase 3 (ADH3) was from Candida magnolia.AIDI and ADH3 for catalytic synthesis (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate has high catalytic activity and stereoselectivity. Mutation AIDI enzyme is by ADH3 through Site directed Mutagenesis, cofactor-dependent from the original completely depend on the NADPH to rely solely on NADH. This paper studies the ADH3 and AIDI purification and enzymology properties. Based on the enzymatic properties of AIDI, AIDI catalytic conditions was optimized. In order to  improve the efficiency of enzyme catalysis, the E.coli Rosetta(pET-22b-AIDI-GDH)is constructed, and applied to all cells catalytic synthesis (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate.

Free enzyme catalysis synthesis (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate. Implements the coenzyme efficient recycling, and the catalytic conditions are optimized. Catalytic reaction of the optimum temperature was 30 ° C, the optimum pH was 7.0,the optimum NAD was 0.2 mmol/L, the optimum enzyme amount was 30 U/mL. The optimal level of glucose was 4:1. The higher the substrate concentration, the lower conversion rate. In optimal conditions, 50 g/L (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxo-hexanoate after 12 h conversion, the conversion can reach 94%, e.e. gt; 99%.

Catalysis using alcohol dehydrogenase (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxo-hexanoate, not only for the high yield, high optical purity of (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate, also for other provides a theoretical reference to the research on the synthesis of chiral compounds, has great industrial prospect.

Key words: (3R,5S)-6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate Alcohol Dehydrogenase

biocatalysis (S)-6-chloro-5-hydroxy-3-oxo-hexanoate

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 绪论 1

1.1 手性化合物 1

1.2 手性化合物的研究方法 1

1.3 制备（3R,5S）-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的研究进展 2

1.3.1 化学法 2

1.3.2 生物法利用野生菌的催化 3

1.4 醇脱氢酶简介 4

1.5 醇脱氢酶的辅酶再生 5

1.5.1 酶偶联法 5

1.5.2 底物偶联法 5

1.6 本课题的研究内容 6

第二章 ADH3与AIDI的纯化和酶学性质研究 7

2.1 前言 7

2.2 材料与试剂 7

2.2.1 实验材料 7

2.2.2 实验试剂 8

2.2.3 菌株与质粒 11

2.2.4 培养基 11

2.3 实验方法 11

2.3.1 AIDI与ADH3的诱导表达 11

2.3.2 AIDI与ADH3的粗酶制备和酶活测定 12

2.3.3 AIDI与ADH3的纯化 12

2.3.4 AIDI与ADH3的酶学性质研究 12

2.3.4 不同底物浓度对催化反应的影响 13

2.3.5 (S)-6-氯-5-羟基-3-羰基己酸叔丁酯与(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟

基己酸叔丁酯的检测方法 13

2.4 结果与讨论 15

2.4.1 AIDI与ADH3的诱导表达 15

2.4.2 AIDI及ADH3的酶活测定 15

2.4.3 AIDI与ADH3的纯化 16

2.4.4 AIDI与ADH3的酶学性质 18

2.4.5 底物浓度对AIDI催化效率的影响 22

第三章 结论与展望 24

3.1 本章小结 24

3.2 展望 25

参考文献 26

致谢 29

第一章 绪论

1.1手性化合物

手性是自然界的本质属性之一，具有这种不对称特性的化合物称为手性化合物。生命活动的化学过程对手性化合物具有很高的立体选择性，可以说生命活动的大分子物质都是由手性单体构成的。如DNA是右旋的，糖多为D构型，组成蛋白质的氨基酸是L型。手性化合物的两个不同对映异构体之间通常具有相似的理化特性，但也有一些理化特性具有极大的差异，甚至具有完全不同的生物活性。如部分手性药物，手性药物是指分子结构中具有不对称中心或手性中心的药物，手性药物的不同对映体之间可能具有明显不同的药理活性。这是因为生物大分子中比如核酸或酶都具有固定的手性结合位点，手性药物会严格的与生物大分子的结合位点进行手性配对并产生诱导契合作用，从而抑制或激活生物大分子的生理活性^[1].。因此同种化合物的不同对映体在作为药物时应视为不同的物质。例如氨氯地平(narofdiPine)的(S)-异构体可用于治疗各种类型的高血压、心绞痛，而(R)-异构体可用于减少脂肪在动脉壁累积及抑制胶原合成，因而具有抗动脉硬化作用。与此类似的还有非甾体抗炎药酮基布洛芬，(S)-对映体用于消炎止痛，(R)-异构体则用作牙膏的添加剂，用来治疗骨质疏松^[2]。而目前市场上出售的手性药物绝大多数是以消旋体的形式给药的,即手性药物的左旋体与右旋体各半的混合物^[3]。这有可能对生物体造成严重的伤害，如上世纪50年代末期的“反应停”事件给了人们惨痛的教训。因此手性纯的药物的合成至关重要，不仅可以排除有害对映体的不良作用，而且可以减轻人体的代谢负担，提高药物作用的特异性^[4]。美国FDA于1992 年公布了题为“新立体异构药物开发政策声明”的手性药物法规管理指南，随后欧盟于1994年公布了“手性物质研究”的文件^[5-6]。这些文件的颁布大大促进了手性药物的发展，据资料统计, 2005 年世界手性药物的总销售额达到1720亿美元，2010年的销售额达已8500亿美元^[7]。.因此手性药物的合成具有广阔的市场前景和应用价值。

1.2 手性化合物的研究方法

手性技术即生产手性化合物的技术，也称手性合成。由于手性化合物具有两个或两个以上的对映异构体，因此如何有效制备或分离各种异构体一直是科学家关注的问题。巴斯德是手性合成研究的先驱，本世纪更是手性技术大发展的世纪，获得手性化合物的主要方法分为：手性源、消旋体拆分和不对称合成等主要的集中方法。

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