论文总字数：18774字

摘 要

固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。本文以大孔吸附树脂为固定化酶载体，比较三种固定化方法吸附-交联法（CIS）、载体活化后固定（SCI）和酶交联后固定（ECI），得出吸附—交联法效果较好。并筛选出一种固定化酶酶活力高和蛋白质吸附量大的树脂即HA型树脂。

通过对固定化核酸酶P1性质研究表明：游离酶和固定化酶的最适温度和最适pH均为70℃和5；而固定化酶的表观活化能（Ea=76.53 kJ/mol）低于游离酶的表观活化能（Ea=154.32 kJ/mol）；动力学方面，固定化酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别为7.865mg·mL-1和443.95U·min-1·mL-1，而游离酶的米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）分别为1.165mg·mL-1和1667.18 U·min-1·mL-1。

对固定化核酸酶P1的固定床连续催化表明：在以高纯度的RNA溶液为底物时，固定化酶能够很好的实现连续催化效能；同时，载体的重复利用效果较好

关键词：核酸酶P1 固定化酶 大孔吸附树脂

Studies on nuclease P1 immobilized by macroporous absorption resin

Abstract

Immobilized enzyme has many advantages, especially, the stability and immobilization has been used widely in many fields. This context is based on macroporous adsorption resin immobilized enzyme carrier, compare three methods of immobilization CIS, SCI and ECI, and find the adsorption - crosslinking method effect is the best. Filter out a large amount of high immobilized enzyme enzyme activity and protein adsorption carrier of HA.

By immobilized nuclease P1 properties showed that the optimum temperature of free enzyme and immobilized enzyme and the optimum pH is 70 ℃ and 4.5; And immobilized enzyme of the apparent activation energy (Ea = 76.53 kJ/mol) less than the free enzyme of the apparent activation energy (Ea = 154.32 kJ/mol); Dynamics, immobilized enzyme michaelis constant (Km) and the maximum reaction rate (Vmax) were 7.865 mg·mL-1 and 443.95U·min-1·mL-1, and free enzyme michaelis constant (Km) and the maximum reaction rate (Vmax) were 1.165 mg·mL-1 and 1667.18 U·min-1·mL-1.

Immobilized nuclease P1 fixed bed continuous catalytic showed that in solution with high purity of the RNA substrates, immobilized enzyme can achieve good continuous catalytic efficiency. At the same time, the carrier reused effect is better.

Key Words: nuclease P1; immobilized enzyme; Macroporous adsorption resin

目录

摘 要 I

Abstract II

目录 1

第一章 文献综述 1

1.1 核酸酶 P1的性质 结构和作用机制 1

1.1.1 核酸酶 P1的性质和用途 1

1.1.2 核酸酶 P1的结构 1

1.1.3 核酸酶 P1的活性部位结构及作用机制 3

1.2 酶的固定化 4

1.2.1常见固定酶的方法 4

1.2.2 大孔树脂固定核酸酶 6

1.3 本文的研究思路、主要内容和目的 6

第二章 实验部分 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 载体材料 7

2.1.2 实验所用药品 7

2.2 实验仪器 8

2.3 实验方法及内容 8

2.3.1 各种溶液的配置 8

2.3.2 树脂的处理 9

2.3.3 酶的固定化 9

2.3.4核酸酶P1的纯化 10

2.3.5 酶学性质分析 10

2.3.6固定化酶的重复利用 11

2.3.7固定化酶的连续催化 11

第三章 结果与讨论 13

3.1 核酸酶P1的纯化 13

3.1.1蛋白质标准曲线的绘制 13

3.1.2 核酸酶P1的纯化 13

3.2固定化酶载体的选择 14

3.2.1不同树脂的蛋白吸附量 14

3.2.3四种树脂的固定化酶酶活 15

3.3 三种不同固定化方法重复利用的研究 16

3.4 载体量对固定化酶活力的影响 17

3.5游离酶和固定化酶的性质 18

3.5.1 温度对固定化酶活性的影响 18

3.5.2 pH对固定化酶活性的影响 20

3.5.3游离酶和固定化酶的动力学研究 20

3.6固定化酶的连续催化 22

3.6.1核苷酸分析方法 22

3.6.2 固定化床连续催化 23

第四章 结论与展望 24

4.1 结论 24

4.2 展望 24

参考文献 25

第一章 文献综述

1.1 核酸酶 P1的性质 结构和作用机制

1.1.1 核酸酶 P1的性质和用途

核酸酶Pl^[1](EC3.1.30.1)是一种含锌金属酶,由桔青霉(Penicilliumcitrinum)发酵制得,可以水解RNA和热变性DNA的磷酸二酯键而得到5’-核苷酸和5’-脱氧核苷酸。脱氧核苷酸在临床上主要用于医治白血球细胞减少症,对再生障碍性贫血、血小板减少、肝炎等病症也有较好的疗效。广泛应用的生物工程试剂脱氧核苷三磷酸是脱氧核苷酸通过酶催化磷酸化得到的,脱氧核苷酸由脱氧核糖核酸酶水解得到的5’一脱氧核酸是合成脱氧核酸类药物的重要原料,用核酸酶Pl催化水解热变性DNA制取脱氧核苷酸是制备这类药物的有效方法之一。

早在50年代，国外就开始从蛇毒或小肠粘膜中提取核酸酶P1用于生物核苷酸；60年代开始，一些国家用微生物发酵的方法生产核酸酶P1获得成功；随着蛋白质提纯技术的发展和晶体学在生物学中的应用，人们对该酶蛋白的分子结构和活性中心有了更多的了解，同时也进一步扩展了核酸酶P1在食品、医药、以及分子生物学等方面的应用前景^[2]。核酸酶P1的结构和酶学特性的研究，对于发展我国核酸酶工业有着重要的理论和现实意义.

1.1.2 核酸酶 P1的结构

1.1.2.1核酸酶P1的一级结构

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