论文总字数：18622字

摘 要

微生物油脂具有重要的作用，解脂耶氏酵母是产微生物油脂的潜力菌株。该实验在单因素对解脂耶氏酵母发酵产油脂的液体培养基优化的基础上，以生物含量和油脂含量为响应值，采用响应面法优化确定其最佳培养基成分和条件。首先通过单因素实验筛选出影响解脂耶氏酵母发酵产油脂的显著因素，得出对解脂耶氏酵母产油脂影响显著的因素为葡萄糖，酵母提取物, Yeast Nitrogen Base Without Amino acids（YNB），pH；通过最陡爬坡试验缩小最优的条件的范围；最后通过Central Composite设计及响应面分析确定解脂耶氏酵母发酵产油脂的最佳培养基成分及条件。结果表明：葡萄糖80g/L，酵母提取物9 g/L，YNB 8 g /L，pH 4，接种量为100％的条件下发酵培养时，解脂耶氏酵母发酵产油脂达到最佳，生物量8.779 g/L，和油脂含量0.1689 g/g，通过优化实验，解脂耶氏酵母达到了较高的产油脂能力，为酵母进一步用于工业化生产奠定了基础。

关键词：解脂耶氏酵母，微生物油脂，响应面法，发酵，优化

Research of Yarrowia lipolytica fermentation process optimization oil

Abstract

Microbial oil has important functions, Yarrowia lipolytica is an potential strain to produce microbial oil. This experiment uses Response surface analysis to find the best component and condition of the medium , based on the optimization of the liquid medium by some single factors , responsed by the amount of biological content and oil content. Firstly, we selected the significant factors influencing the Yarrowia lipolytica in producing oil, which are the glucose, yeast extract, Yeast Nitrogen Base Without Amino acids（YNB）and pH; Secondly, we narrowed the range of the condition by the steepest climb test; Lastly, we found the best component and condition of the medium for the Yarrowia lipolytica to produce oil by the Central Composite design and the Response surface analysis. The result is: under the condition of ‘glucose 80g/L, yeast extract 9g/L, YNB 8g/L,PH 4, Inoculation quantity 100%’, the production of oil by Yarrowia lipolytica is best(Biomass 8.799g/L, oil content0.1689g/L). The experiment improves the ability of Yarrowia lipolytica to produce oil, which lays the foundation of the further application of the yeast in the industrial production.

Key Words: Yarrowia lipolytica ;Microbial Oil; Response surface analysis; Fermentation; Optimization

目 录

摘 要 II

Abstract III

第一章 引言 1

1．1 解脂耶氏酵母的简介 1

1．1．1 解脂耶氏酵母的分子生物学特性 2

1．2 响应面方法 3

第二章 实验材料与方法 7

2.1 菌种 7

2.2 培养基 7

2.2.1 种子培养基 7

2.2.2发酵培养基 7

2.2.3 摇瓶发酵培养 7

2.3 主要仪器和试剂 7

2.4 实验方法 9

2.4.1 YPD培养基 9

2.4.2 种子培养 9

2.4.3 发酵产油培养 9

2.4.4 油脂提取 9

2.4.5 甲酯化 9

2.4.6 发酵培养基的优化 10

2.4.7 生物量测定的方法 10

第三章 结果与分析 11

3.1 葡萄糖标准曲线的配置 11

3.1.1 葡糖糖标准液的配置 11

3.1.2 葡萄糖标准曲线的绘制 11

3.2 单因素实验 12

3.2.1 碳源的不同浓度对发酵产油脂的影响 12

3.2.2 有机氮源的不同浓度对发酵产油脂的影响 13

3.2.3无机氮源的不同浓度对发酵产油脂的影响 14

3.2.4 不同pH对发酵产油脂的影响 15

3.2.5 不同接种量对发酵产油脂的影响 16

3.3 Plackett-Burman设计法筛选重要因素 17

3.4 响应面方法Central Composite实验设计 18

3.5 响应面分析 19

3.6解脂耶氏酵母发酵产油脂最优化条件的确定 24

结论 25

参考文献 26

致谢 28

第一章 引言

1．1 解脂耶氏酵母的简介

解脂耶氏酵母( Yarrowia lipolytica ) 是非常规酵母中具有代表性的一种，它的底物非常的多, 比如有亲水性碳源（如葡萄糖、甘油等）与疏水性碳源（如脂肪酸、烃类、油脂等）。该酵母可以生产很多代谢产物，特别是有机酸(柠檬酸、异柠檬酸),蛋白类(蛋白酶、脂肪酸、酯酶、磷酸酶、α- 甘露糖苷酶、RNase)。烷烃类的廉价物质当做底物可以分泌非常多的代谢产物，从上世纪四十年代被发现以来相当的受到研究者们的重视，并且在上世纪九十年代被开发当做一种新的酵母的表达系统，用来作为42种异源蛋白的高效表达。总结了解脂耶氏酵母的特点和它的表达系统，便于研究者从翻译和转录的水平研究异源蛋白在此菌中的表达分泌路径，并且能够寻找到调控型启动子^[1]。

解脂耶氏酵母在1942年第一次被分离得到，从而被命名称作Candida lipolytica、 Endomycopsis lipolytica、Sacharomycopsis lipolytica，最终被定名为Yarrowia lipolytica (解脂耶氏酵母)。解脂耶氏酵母是非常规酵母中的一种。日常所说的非常规酵母是排除了了酿酒酵母和粟酒裂殖酵母它们之外的所有酵母的总称，也包括了：毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、解脂耶氏酵母等^[2]。解脂耶氏酵母的优点^[3]在于:（1)解脂耶氏酵母被研究者们认为是安全可靠地(Generaly Regarded As Safe )，从而可以用于食品于药物的生产上面；（2)它可以非常多的分泌大量代谢产物，自从上世纪六十年代就开始被当做食品使用、SCP(Single-Cell Protein)等的工业化生产；（3)它可以利用相当多的普通的碳水化合物与脂肪当做碳源，这也使得它更加适合于各种的工业应用中；（4)它作为非常规酵母中离酿酒酵最远的一个种属，这就提供了一个相当特别的视角用来研究半子囊菌纲的进化过程与保守性。（5)它的全基因组序列与线粒体序列已经被测定。（6)到现在为止，研究者们对解脂耶氏酵母的代谢过程、蛋白分泌途径、过氧化物酶体、二态性信号转导途径等生化与分子方面进行了较非常深入的研究。（7)在解脂耶氏酵母中共转运占主导地位，糖基化的程度低，这些累似于高等真核生物。（8)解脂耶氏酵母用它不同于其它酵母的特性变成了研究酵母形态学、蛋白分泌、线粒体复合体Ⅰ和过氧化物酶体的模型。

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