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摘 要

为了将甜菊糖中含量高并且具有较强后苦味的甜菊甙催化合成高甜度的莱鲍迪甙A ，本课题以大肠杆菌为研究对象，通过优化发酵产酶过程，从糖基转移酶和蔗糖合成酶双酶偶联的角度出发，通过改善催化反应条件，改变底物蔗糖的浓度，粗酶的用量，以及反应温度和反应体系的PH值，以期较大地提高产物RA的产量。最后通过建立以 RA作为标准品的高效液相色谱检测法，检测最终产物的转化率。

结果发现合成莱鲍迪甙A最佳优化体系应为：温度32℃，Stevioside（ST）的浓度为30mmol/L，蔗糖（Suc）的浓度为100mmol/L，氯化镁（MgCl₂）的浓度为3mmol/L，粗酶的浓度为9mg/mL，100mmol/L磷酸钾缓冲液（pH=7.2）若干。最终的转化率预测达到92%以上。

关键词：糖基转移酶；蔗糖合酶；催化合成；条件优化；莱鲍迪甙A

ABSTRACT

For the high content of stevioside and stevioside have a strong catalytic synthesis of high sweetness after bitterness rebaudioside A, this study E. coli as the research object, by optimizing the enzyme production process, from glycosyltransferase and sucrose synthase enzyme conjugated double perspective, by improving the catalytic reaction conditions, varying the concentration of the substrate sucrose, crude enzyme dosage and reaction temperature and PH value system, in order to greatly improve the product RA production. Finally, the establishment of RA as a standard HPLC assay to detect the conversion rate of the final product.

It was found that the synthesis of rebaudioside A best optimization system should be: temperature 32 ℃, Stevioside (ST) at a concentration of 30mmol / L, sucrose (Suc) the concentration of 100mmol / L, magnesium chloride (MgCl₂) concentration of 3mmol / L, the concentration of the crude enzyme was 9mg / mL, 100mmol / L potassium phosphate buffer (pH = 7.2) several. The final conversion rate forecast to reach more than 92%.

Key words: glycosyltransferase ; sucrose synthase ; catalytic synthesis ; Optimization;

Rebaudioside A

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

目 录 III

第一章 文献综述 1

1.1 莱鲍迪甙A概述 1

1.1.1 甜菊糖 1

1.1.2 莱鲍迪甙A 1

1.1.3 莱鲍迪苷A 的物化性质 3

1.2 莱鲍迪甙A研究现状 3

1.2.1 莱鲍迪甙A的制备----树脂法 3

1.2.2 莱鲍迪甙A的制备----重结晶法 3

1.2.3 生物合成莱鲍迪甙A 3

1.3 莱鲍迪甙A的检测 4

1.3.1 高效液相色谱法( HPLC) 4

1.3.2 薄层色谱法( TLC) 4

1.3.3 液滴逆流分配层析( DCCC) 4

1.3.4 毛细管电泳( CE) ,4

1.4 糖基转移酶的概述 4

1.5 蔗糖合酶 5

1.6 本论文的研究目的和内容 6

第二章 酶法合成莱鲍迪甙A的反应体系及条件优化 7

2.1 前言 7

2.2 材料与方法 7

2.2.1 实验仪器 7

2.2.2 实验用到的菌株与质粒 8

2.2.3 工具酶，分子量标准和试剂盒 8

2.2.4 实验试剂 9

2.2.5 菌株与培养基 9

2.3 实验方法 10

2.3.1 提质粒进行鉴定 10

2.3.2 培养大肠杆菌（Petduet-Ugt-Sus） 11

2.3.3 粗酶的制备 11

2.3.4 蛋白浓度的测定 12

2.3.5 催化合成的反应体系 12

2.3.6 反应体系温度的改变 12

2.3.7 反应体系粗酶浓度的改变 12

2.3.8 反应体系底物蔗糖（Suc）的改变 12

2.3.9 反应体系pH的改变 13

2.4 HPLC法测定莱鲍迪甙A 13

2.4.1 标品的制备 13

2.4.2 样品的制备 13

2.4.3 色谱条件 13

2.5 实验结果与讨论 13

2.5.1 质粒验证 14

2.5.2 大肠杆菌的OD值 14

2.5.3 粗酶的蛋白浓度 14

2.5.4 标准曲线 14

2.5.5 温度对反应体系的影响 15

2.5.6 酶浓度对反应体系的影响 16

2.5.7 底物蔗糖（Suc）对反应体系的影响 17

2.5.8 pH值对反应体系的影响 18

第三章 主要结论与展望 19

3.1 主要结论 20

3.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 25

第一章 文献综述

1.1 莱鲍迪甙A概述

1.1.1 甜菊糖

甜叶菊，原产地在南美，从中提取的甜菊糖在我国的生产已经有20多年的历史，甜菊糖苷是一种天然高倍甜剂，热量低，是从南美巴拉圭的小灌木甜叶菊的叶子中提取获得。在国际上，甜菊糖有“世界第三蔗糖”^[1]的美誉。

甜菊糖具有热量低、甜度高、易溶解等特点，它的甜度大约是蔗糖的200倍，而热值大约只有蔗糖的1/300^[2]。由于甜菊糖的这些特点，渐渐受到了大众的喜爱，并且取代了一些由人工合成的甜味剂。1999年我国修订了甜菊糖标准（GB 8270-1999），确认甜菊糖可以作为食品添加剂。甜菊糖得到了国内外科研机构的认可，其对口腔疾病、心血管疾病等疾病有一定的辅助治疗作用^[3,4]，且对高血压有一定的疗效。现今世界上最大的甜菊糖出口国是我国，且多应用于化工、食品等行业^[5]。由于当前市场上的甜菊糖存在后苦味，很大程度上影响了其市场占有份率。

1.1.2 莱鲍迪甙A

当今研究表明，甜菊糖由不同糖甙组成的，不同的糖甙存在了很大的口感差异度^[6]。迄今为止，从甜叶菊中分离出的不同甜度的甜菊糖^[7] (见表1-1)多达8种。甜菊甙（Stevioside，St甙）最早被人们发现，是甜菊叶中的主要成分，一般占总甙的55%以上，但是甜菊甙有比较强的后苦味；莱鲍迪甙A（RebaudiosideA，RA甙）的口感和甜度均佳，而且没有不良余味，是甜菊糖甙中口味最好的成分，但是RA甙大约只占总甙的20%^8,9]。甜菊糖甙的口感和甜度大多取决于St甙和RA甙的含量比例，要改善甜菊糖味质，提高甜菊糖中RA甙的含量是关键。

表1-1 不同甜菊糖的甜度及其含量^[10]

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