论文总字数：16325字

摘 要

本研究以核苷酸双磷酸酶IDP为主要研究对象，通过分子构建将其与大肠杆菌外膜蛋白OmpXK122融合表达，旨在将IDP酶蛋白展示在大肠杆菌外膜，通过全细胞催化实现核苷二磷酸的水解。

准备阶段，我们通过在数据库National Center for Biotechnology Information（NCBI）上查找含有OmpX以及IDP的序列,截取OmpXK122并设计引物。我们首先是进行了OmpXK122与IDP基因片段的克隆，利用大肠杆菌细胞表面展示技术在载体pTrc99a上的EcoRI和XbaI位点之间插入OmpXK122片段之后，紧接着做酶切产物胶回收，回收产物做连接，并将pTrcOmpXK122质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)。与此同时，我们还将IDP基因片段与pEAYS-Blunt Simple 载体进行平末端连接，最后再用XbaI单酶切pTrcOmpXK122质粒，在pTrcOmpXK122质粒XbaI位点插入IDP，构建成重组pTrcOmpXK122IDP质粒并对其诱导表达的调控机制进行初步探索。

关键词：核苷酸双磷酸酶；表面展示技术；大肠杆菌；重组质粒

ABSTACT

In this paper, to as the main object, it is a nucleotide double phosphatase IDP conduct a complete study, including its molecular biological cloning, microbial metabolism and enzymatic activity system.

During the preparation phase, we search in the database National Center for Biotechnology Information (NCBI) for the sequence containing OmpX and IDP, truncated the sequence OmpXK122 and designed primers.We first cloned OmpXK122 and IDP gene fragments. Taking advantage of the E. coli cell surface display technology, insert segments（OmpXK122） between the EcoRI and XbaI sites on the carrier （pTrc99a）. Then, digestion products was recycle, recycling product made the connection, and pTrcOmpXK122 plasmid was transformed into E. coli BL21 (DE3).At the same time, we will do the blunt-end ligation of fragment(IDP) and carrier (pEAYS-Blunt Simple). Finally, the plasmid(pTrcOmpXK122) was digested with single enzyme (XbaI). Insert IDP in plasmid(PTrcOmpXK122) at Xbal site.Then,we construct the recombinant plasmid and begin to initial exploration of regulation mechanism of inducible expression.

Keywords: nucleoside triphosphate-diphosphohydroases; surface display technology; E.coli; recombinant plasmid

目录

摘 要 I

ABSTACT II

目录 III

第一章 综述 5

1.1 核苷酸双磷酸酶的概述 5

1.1.1 核苷酸双磷酸酶的介绍 5

1.1.2 大肠杆菌表面展示体系的介绍与优点 5

1.2 本论文的研究目的和内容 6

第二章 实验部分 8

2. 1 材料与方法 8

2.1.1菌株和载体（材料部分） 8

2.1.2培养基 8

2.1.3所用试剂 8

2.1.4工具酶，分子量标准和试剂盒 9

2.1.5 实验仪器 9

2.1.6 OmpXK122和IDP的分子克隆 10

2.1.6.3 PCR 克隆 12

2.1.7 OmpXK122片段在载体pTrc99a上的构建 15

2.1.8 IDP片段在载体pEAYS-Blunt Simple上的构建 18

2.1.9将IDP插入pTrcOmpXK122质粒中 18

2.1.10 重组质粒pTrcOmpXK122 IDP的诱导表达 18

2.1.11 SDS-PAGE蛋白电泳 19

2.2结果与分析 19

2.2.1 W3110基因组提取 19

2.2.2 PCR扩增 19

2.2.3 酶切产物胶回收 21

2.2.4 双酶切验证 21

2.2.5 蓝白筛筛选阳性克隆结果 23

2.2.6 重组IDP诱导结果 23

2.2.7重组菌株生长曲线 24

2.2.8全细胞催化 25

第三章 结论与讨论 26

3.1结论 26

3.2 讨论 26

参 考 文 献 27

致 谢 30

第一章 综述

1.1 核苷酸双磷酸酶的概述

1.1.1 核苷酸双磷酸酶的介绍

核苷酸双磷酸酶IDP是水解NDP/NMP的酶，属碱性磷酸酶，目前国内外对该酶的报道较少，已报道基因序列主要来源为人和动物，该酶可用于核苷二磷酸和核苷单磷酸的定量检测分析。我们利用该特异性磷酸酶，加入到糖基转移反应中从而从该糖基反应组中释放出定量的无机磷酸盐，所释放出的磷酸盐通过孔雀绿试剂用比色法检测。因为被释放出的磷酸盐的数量直接与糖基转移酶反应中被转移的糖分子数量成正比，所以这个方法被用来获取糖基转移酶的精确动力学参数。该检测方法可以在多孔板中进行，并在培养皿观看盘中定量化，适用于高通量检测。它已经成功地应用于所有我们可获得的糖基转移酶，包括葡萄糖糖基转移酶，N-乙酰基葡萄糖糖基转移酶，N-乙酰基半乳糖转移酶，半乳糖转移酶，岩藻糖基转移酶，唾液酸转移酶。

1.1.2 大肠杆菌表面展示体系的介绍与优点

微生物表面展示 (Surface display) 是一种具有广泛应用价值的基因操作技术，通过将靶蛋白基因序列与特定的载体蛋白基因序列融合后导入微生物宿主细胞，靶蛋白在载体蛋白的引导下表达并固定于宿主菌细胞表面，它使表达的外源肽 (或蛋白质的结构域) 以融合蛋白形式展现在噬菌体或细胞的表面，被展示的多肽或蛋白质可以保持相对独立的空间结构和生物活性，因而可以用于多肽性质、相互识别和作用的研究，以及构建和筛选蛋白文库、开发活疫苗等等。

第一个表面展示系统由Geroge P. Smith 等于1985年建立，他利用丝状噬菌体M13 的pIII 蛋白将抗体固定在噬菌体表面，为抗原的生产提供了一种新的技术和方法。该实验的成功使表面展示系统引起了研究学者们越来越广泛的关注，并建立了多样的表面展示系统。根据采用宿主细胞的不同微生物细胞表面展示系统可分为噬菌体展示系统、细菌展示系统和酵母展示系统。噬菌体展示系统是研究得最早的比较成熟的系统。噬菌体展示系统目前主要用于从复杂的文库中

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