论文总字数：22041字

摘 要

Surfactin是一类重要的生物脂肽类表面活性剂，其分子结构中的亲水基和亲油基分别由多肽链与脂肪碳链构成。Surfactin具有抗菌活性强，生物降解性好，毒性低，污染小等优点，因此在生物医药、食品、化妆品和石油等领域有着重要的应用前景。

本文以产高产Surfactin（C13、C14、C15）菌株枯草芽孢杆菌-44-10为研究菌株，通过5L发酵罐在适宜的条件下制备得到含有Surfactin的泡沫发酵液，通过酸沉法进行Surfactin的初步分离，获得纯度为31.2 %的粗产品，再通过探索制备色谱条件，以0.05 %三氯乙酸水溶液(10 %，v/v)，甲醇（90 %，v/v）为流动相，60 g的KP-C18-HS 反相色谱分离柱为固定相，进一步分离纯化出Surfactin三种碳链长度不同的（C13、C14、C15）样品。最终确定制备色谱收集不同成分的时间分别为：C13为28.56 min-30.58 min，C14为31.04 min-32.04 min，C15为37.52 min-39.45 min。经过分离分别得到C13的比例为95 %，C14的比例为82 %和C15的比例为90 %的Surfactin。

关键词：Surfactin 枯草芽孢杆菌 分离纯化 高效液相色谱 制备色谱

The Separation and Purification of Surfactin Fat Peptides

Abstract

Surfactin is a kind of important biological lipopeptide surfactant. The hydrophilic groups and lipophilic groups in its molecular structure respectively consist of polypeptide chain and aliphatic carbon chain. Surfactin has many advantages, such as strong antibacterial activity, good biodegradability, low toxicity and low pollution, so it has important application prospects in the fields of biological medicine, food, cosmetics, petroleum and so on.

In this paper, we used bacillus subtilis NJtech-44-10 as the research object, which has high yield of surfactin(C13, C14, C15). The foam fermentation broth containing surfactin was prepared in 5 L fermentor in suitable conditions. Crude product of surfactin is separated by acid precipitation, which has the purity of 31.2 %. We explore the condition of chromatographic to obtain higher purity surfactin, and separate three different carbon chain length of surfactin samples (C13, C14, C15) by using 0.05 % (10 %, v/v) trichloroacetic acid and methanol (90 %, v/v) as mobile phase, 60 g reversed chromatographic column(KP-C18-HS) as stationary phase. The final condition is that: the acquisition time of C13, C14 and C15 are 28.56-30.58 min, 31.04-32.04 min and 37.52-39.45 min, respectively. After separation, obtain the ratio of C13 was 95%, the ratio of C14 was 82% and the ratio of C15 was 90%, respectively.

Key Words: Surfactin; Bacillus subtilis; Separation and purification; High performance liquid chromatography; Preparative chromatography

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 Surfactin 1

1.1.1 生物表面活性剂的概述 1

1.1.2 Surfactin的结构 2

1.1.4 Surfactin的性质 3

1.1.5 Surfactin的应用 3

1.2 Surfactin的分离提取方法 5

1.2.1沉淀法 6

1.2.2萃取法 6

1.2.3色谱法 6

1.2.4 吸附法 7

1.3 研究目的和意义 7

第二章 材料与方法 8

2.1 材料与设备 8

2.1.1 菌种来源 8

2.1.2 材料 8

2.1.3 培养基 8

2.1.4 设备 9

2.2 实验步骤 10

2.2.1 Surfactin发酵液的准备 10

2.2.2 Surfactin的粗提取 11

2.2.3 Surfactin的精制 12

2.2.4 表面张力的测定 12

第三章 数据分析与实验结论 14

3.1 Surfactin的浓度分析 14

3.2 制备色谱的条件探索 14

3.2.1 流动相比例的优化 14

3.2.2 C13、C14、C15收集时间的确定 17

3.3 表面张力的分析比较 20

3.4 总结 21

3.5 展望 21

参考文献 22

致谢 25

第一章 文献综述

1.1 Surfactin

1.1.1生物表面活性剂的概述

生物表面活性剂（biosurfactant）是由自然界存在的微生物或植物等生命体经生长代谢过程所产出的具有表面活性的一类物质，按照其结构特征，可以分为五大类，分别为：糖脂类表面活性剂、脂肽类表面活性剂、磷脂类表面活性剂、聚合类表面活性剂类和微粒类表面活性剂类等^[1]，具体的分类以及产生菌株可见表格1.1。而其中脂肽类的生物表面活性剂具备独特的表面活性以及高效的抗菌活性，引起了越来越多科研工作者的关注，近些年来在生物医药、环保材料等方面均有广泛的应用前景。有相关报道表明，目前已经有许多的脂肽类表面活性剂被发现，如Surfactin、Fengycin、Bacillomycin、Iturin等^[2]。1968年，生物表面活性素（Surfactin）首次被 Arima 等人^[3]发现，Surfactin是由枯草芽孢杆菌产生的，它不仅可以降低水的表面张力，还可以加疏水烃类的生物可降解性。有研究报道表明，在25 ℃的环境下，Surfactin在浓度为20 mg/L甚至低于20 mg/L时，能够把去离子水的表面张力从72 mN/m降至27 mN/m。此外，它还有几个突出的优点，例如，生物降解能力强，毒性低，生物相容性优于其它用化学的方法来制备的表面活性剂等。

表1.1 生物表面活性剂的分类和其产生菌株的类型

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