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摘 要

纽莫康定B₀ 是一种酯肽类化合物，同时也是王牌抗真菌药物卡泊芬净的重要前体。纽莫康定B₀是由一种名为Glarea. lozonolysis的真菌发酵产生的一种脂肽类化合物。纽莫康定B₀抗真菌的作用机理在于它能够特异性地抑制真菌细胞壁的生长，抑制葡聚糖合成酶的活性，从而能够达到抗真菌的目的，并且不对人体产生影响。我们通过PCR技术大量合成目标基因片段，再导入感受态大肠杆菌细胞E.coli BL21（DE3）中，诱导表达出目标蛋白质，再次纯化后即可得到高纯度目标蛋白。结果表明：利用设计的6-Pro-A2-S和6-Pro-A2-A为引物，以菌株G. lozoyensis的总DNA为模板，对腺苷化功能域进行PCR扩增，然后利用EcoRI和HindIII双酶切，同时将pET28a进行相同酶切，回收pET28a片段序列，连接两者，获得重组质粒pET28a-Pro。腺苷化功能域片段被成功地插入了重组质粒中。其最佳诱导温度为30℃，诱导剂IPTG的最佳浓度是1 mmol/L。表达蛋白采用MagExtractor-His-Tag纯化试剂盒一步纯化，酶学性质的研究表明：该酶最适作用pH和温度分别为6.8和25 ℃，在 pH6.8～8.0具有稳定性。EDTA、K 、Mg² 、Zn² 、Fe² 对目标酶活力均有一定的抑制作用。

本研究对纽莫康定B₀大规模生产及相关酶学性质研究有积极的意义。

关键词：纽莫康定B₀ 腺苷化结构域 蛋白质的纯化 PCR

Pneumocandin B₀ synthetic gene cluster polyadenylation domain protein Purification and Enzymatic properties

Abstract

Pneumocandin B₀ is an ester peptide compounds, but also the ace antifungals caspofungin important precursors. Pneumocandin B0 is called Glarea. Lipopeptide fungal compound produced by fermentation lozonolysis. Pneumocandin B0 antifungal mechanism of action is that it can specifically inhibit the growth of the fungal cell wall, glucan synthase inhibition activity, it is possible to achieve the purpose of anti-fungal, and does not affect the human body. We synthesized a large number of PCR technology target gene fragment was then introduced into competent E. coli cells E.coli BL21 (DE3), and induced the expression of the target protein, the target protein can be obtained with high purity after purification again. The results show that: the use of design 6-Pro-A2-S and 6-Pro-A2-A as primers based on the total DNA of the strain G. lozoyensis as a template for polyadenylation domains amplified by PCR, and then use EcoRI HindIII double digestion, and will perform the same pET28a digested pET28a recovered fragment sequences connection both recombinant plasmid pET28a-Pro. Adenylation domain fragment was successfully inserted into the recombinant plasmid. The optimal induction temperature is 30 ℃, the optimum concentration of inducer IPTG was 1 mmol / L. Protein-step purification MagExtractor-His-Tag purification kits, studies show that the enzymatic properties: enzyme optimum pH and temperature were 6.8 and 25 ℃, pH6.8 ~ 8.0 in having stability. EDTA, K , Mg2 , Zn2 , Fe2 target enzyme activity have a certain extent. Michaelis constant for the enzyme proline is.
In this study, pneumocandin B0 mass production and related enzymatic properties have a positive meaning.

Key Words: Pneumocandin B₀ Adenosine domains Purification of protein PCR

目录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1 纽莫康定B₀简介 1

1.2纽莫康定B₀的生物合成途径 1

1.2.1PKS途径 1

1.2.2NRPS途径 2

1.2.3PKS- NRPS途径 3

1.3腺苷化结构域的介绍 3

1.4蛋白质的纯化 4

1.4.1区带离心法 4

1.4.2层析法 4

1.4.3电泳法 5

1.5酶学性质的研究 6

1.5.1酶活力的测定 6

1.5.2PH对酶活性的影响 6

1.5.3酶的PH稳定性 6

1.5.4温度对酶活性的影响 6

1.5.5酶的热稳定性 7

1.5.6金属离子对酶活性的影响 7

第二章 实验材料 8

2.1实验仪器 8

2.2实验试剂 8

第三章 实验方法 10

3.1 菌种及质粒 10

3.2 培养基的制备 10

3.2.1 培养基配方 10

3.2.2 培养条件 10

3.3 G. lozoyensis总RNA的提取 10

3.4 RT-PCR扩增腺苷化结构域（proA）的cDNA序列 10

3.5 腺苷化功能域组质粒的构建 11

3.6 腺苷化结构域表达条件的优化 11

3.7 粗酶液的制备 11

3.8腺苷化功能域酶活力检测 11

3.9表达蛋白的纯化 12

3.10 蛋白含量测定 12

3.11 SDS-PAGE电泳 13

3.12 米氏常数K_m测定 14

第四章 实验结果与讨论 15

4.1腺苷化功能域的扩增 15

4.2腺苷化功能域重组质粒的构建 15

4.3腺苷化结构域重组菌株的诱导表达 15

4.4酶学性质 16

4.4.1 最适反应pH 16

4.4.2 最适保藏pH 16

4.4.3 最适反应温度 17

4.4.4 最适保藏温度 17

4.4.5 金属离子对反应酶活的影响 18

4.4.6 底物浓度对反应酶活的影响 19

4.5 腺苷化功能域的特异性检测结果 19

4.6目的蛋白纯化结果 19

第五章 结论与展望 21

5.1 结论 21

5.2 展望 21

参考文献 22

致谢 25

1. 文献综述

1.1 纽莫康定B₀简介

纽莫康定B₀是抗真菌药物卡铂芬净的主要前体。从结构上分析，纽莫康定属于棘白菌素化合物抗生素，生产菌为Glarea. lozoyensis^[1-2]，主要有A₀ 和B₀ 两种有效的次级代谢产物。我们可以通过对药效较好的B₀修饰，得到一种具有良好水溶性的半合成衍生物卡泊芬净( Caspofungin )，商品名为赛克斯( Cancidas )。纽莫康定B₀良好的抗真菌效果主要归因于它特殊的结构，纽莫康定B₀具有良好的抗真菌性能主要归因于它的特殊结构，纽莫康定B₀可以抑制葡聚糖合成酶的活性，从而达到抗真菌的效果。卡泊芬净已在全世界70多个国家和地区被广泛使用。相比于过往经常使用的抗真菌药物，卡铂芬净的主要优势有：无溶血毒性、很少与其他药物发生作用。

1.2纽莫康定B₀的生物合成途径

纽莫康定B₀属于微生物菌株G. lozoyensis的次级代谢物。在染色体上的微生物次级代谢物生物合成基因是成集群布置的状态，即结构基因，调节基因，耐药性基因和转运蛋白质等与微生物次级代谢物的合成息息相关的主要基因主要分布在染色体上的一片连续区域内。

根据生物合成的途径来对抗生素合成途径分类，抗生素可以分为通过非核糖体肽合成酶( non-ribosomal peptide synthetases，NRPS )途径合成的抗生素，通过聚酮合成酶( polyketide synthetases，PKS)途径合成的抗生素以及非核糖体肽合成酶-聚酮合成酶( NRPSs-PKS )杂合途径^[3-5]合成的抗生素这几种不同的合成途径。纽莫康定B₀合成途径则属于非核糖体肽合成酶-聚酮合成酶（NRPS-PKS）杂合途径。

1.2.1PKS途径

经典模块化聚酮化合物合酶途径^[6]（Modular PKS）是由基因簇来进行编码的，表达出来的代谢物通常由一到多个不等的肽链构成，而每条肽链又由一到多个数量不等的模块（Modular）构成，每个模块负责一次伸长的过程。延伸反应的过程主要是聚酮二碳单元化

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