论文总字数：19765字

摘 要

N,N-二甲基甲酰胺（DMF）是一种常见的化工溶剂，但由于其毒性和难降解的特点，给环境和人身安全带来了较大隐患。随着人们对环境工程的研究，相比于化学处理法，更经济更节能的生物降解法被用于DMF的处理之中。目前已被发现的能用于处理DMF的微生物有：假单胞菌、噬氨副球菌、产碱杆菌、苍白杆菌等。本课题对铜绿假单胞菌降解DMF进行了相关研究，其中包括了DMF浓度对铜绿假单胞菌生长的影响、铜绿假单胞菌降解DMF的速率以及对铜绿假单胞菌降解DMF机制的研究。实验结果表明：铜绿假单胞菌在DMF浓度为10g/L生长情况较好,且用高效液相色谱法测得DMF降解速率为0.12g/L/h/OD。最后，本实验还构建了铜绿假单胞菌的代谢网络，并在此基础之上，对DMF的降解途径做出了推断：N,N-二甲基甲酰胺脱甲基成N-甲基甲酰胺，再脱甲基成甲酰胺，最后水解为甲酸和酰胺。并且提出两个可能与脱甲基过程相关的酶：N,N-二甲基甘氨酸脱氢酶和肌氨酸（N-甲基甘氨酸）氧化酶。

关键词：DMF降解；微生物；污水处理；铜绿假单胞菌；代谢通路

ABSTRACT

N,N-dimethyl formamide(N,N-DMF) is a widely used solvent in industry. However, owing to its toxicity and difficulty to degrade, it endangers environment and human health. With a rapid development of environmental engineering, biotechnologies are taken into application in the treatment of DMF, which is economical and environmentally friendly. So far, there have been several species of microorganisms capable of degrading DMF: Pseudomonas sp., Paracoccus aminovorans, alcaligenes sp., Ochrobactrum sp., etc. Here, we do research on the biodegradation of DMF by Pseudomonas aeruginosa, including the optimal condition for the growth of P.aeruginosa, the degrading rate of DMF. Besides, we also put forward a possible pathway of the biodegradation and two relevant enzymes. According to our experiments, Pseudomonas aeruginosa grow the best in medium containing 10g/L DMF and its average degrading rate is approximately 0.12g/L/H/OD. Finally, during the biodegradation process of DMF in P.aeruginosa, N,N-dimethyl formamide is demethyled to form N-methyl formamide, then demethyled again to form methyl formamide. And the mehtylformamide is eventually hydrolyzed into ammonia and formate. The first two steps are possibly related to N,N-dimethyl formamide oxidase and sarcosine(N-methyl formamide) oxidase.

Key words: Biodegradation of N,N-dimethyl formamide; Microbiology ; Waste water treatment ; Pseudonomas aeruginosa; metabolic pathway

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 N,N-二甲基甲酰胺 1

1.1.1 N,N-二甲基甲酰胺——一种常用的有有机溶剂 1

1.1.2 N,N-二甲基甲酰胺对环境和人体的危害 1

1.2 生物降解法处理DMF的进展 1

1.3 微生物降解DMF途径 2

1.4 本文的研究内容和目的 3

第二章 DMF浓度对铜绿假单胞菌生长的影响 2

2.1 引言 2

2.2 材料与方法 2

2.2.1 实验仪器 2

2.2.2 实验用到的菌株 3

2.2.3 实验试剂 3

2.3 实验方法 3

2.3.1培养基及培养方法 3

2.3.1.1 培养基成分 3

2.3.1.2 培养方法 3

2.3.1.3 不同DMF浓度培养基中铜绿假单胞菌的生长情况 4

2.4 实验结果与讨论 4

第三章 铜绿假单胞菌DMF降解速率的研究 2

3.1 引言 2

3.2 材料与方法 2

3.2.1 实验仪器 2

3.2.2 实验试剂 3

3.3 实验方法 3

3.4 实验结果与讨论 4

第四章 铜绿假单胞菌降解DMF机制的研究 2

4.1 引言 2

4.2 材料与方法 2

4.2.1 实验仪器 2

4.2.2工具酶，试剂盒和分子量标准 3

4.2.3 实验试剂 3

4.3 实验方法 4

4.4 实验结果与讨论 5

第五章 主要结论与展望 1

3.1 主要结论 1

3.2 展望 1

第一章 文献综述

1.1 N,N-二甲基甲酰胺

1.1.1 N,N-二甲基甲酰胺——一种常用的有有机溶剂

N,N-DMF，即N,N-二甲基甲酰胺，能与水和有机溶剂互溶并具有较高的电解常数^[1-3]。因此，常常在化工产业被化学反应的用作溶剂、助溶剂或反应介质。每年有大量的N,N-二甲基甲酰胺被用于工业生产：仅2001年，在世界范围内，就有285000公吨的N,N-二甲基甲酰胺被直接消耗^[4]，而这个数字正在逐年增长。大量的DMF使用直接导致工业污水中存在着过量的DMF，而这些污水给环境和生物体带来了严重的危害。

1.1.2 N,N-二甲基甲酰胺对环境和人体的危害

据报道，N,N-二甲基甲酰胺可通过口腔^[5]、呼吸^[6]、皮肤^[7]和注射等方式进入生物体，并对体内不同器官造成不同程度的伤害^{[8, 9]}。其中，最为普遍的是DMF的肝毒性^[10-12]，可引起肝炎、肝纤维化、肝硬化及肝癌等多种疾病。此外，有相关报道指出DMF的长期摄入也可导致酒精过敏、胚胎毒性、致畸性^{[9, 13]}及线粒体DNA不可逆变异^[14]。

DMF对于环境的影响体现在其对于动物、植物和微生物的危害上。越来越多的文献显示DMF对于动物的繁殖有抑制作用^[15]；可能对水生植物如绿藻等有杀灭作用^[16]；同时也对水中的微生物具有一。定毒性^[17]。由此可见，DMF的排放可能对环境和人类健康带来威胁，而大量的DMF消耗量使得DMF的治理变得尤为重要。

1.1.3 N,N-二甲基甲酰胺降解法及所面临的困难

目前运用较为广泛的DMF降解法有DMF碱化处理^[18]和生物降解法^[19]。DMF碱化处理法虽然处理效率较高，但工艺路线长、处理成本高且副产物二甲胺仍具有毒性；生物降解法弥补了碱化法高成本的缺点，然而其较慢的降解速率成为制约该工艺发展的重要因素。除此之外，一些其他的方法，如TiO2纤维降解DMF^[20]等方法都因为成本过高等原因无法被广泛运用与实际生产之中。

1.2 生物降解法处理DMF的进展

最早发现微生物能够降解DMF是1986年的Hans-Peter SCHAR等人，首次分离出纯菌种，鉴定为假单胞菌属，并命名为Pseudomonas DMF 3/3^[21]。他们将DMFase纯化出，并测定了酶学性质。随后，TEIZI URAKAMI等人在1990年发表文章，指出噬氨副球菌和脱氨副球菌也可以降解DMF^[22]。1997年，产碱杆菌属也被YOSHIE HASEGAWA等人发现具有DMFase，且两年后他们对DMFase基因进行了克隆，并在大肠杆菌内表^{[23, 24]}。2006年，从矿井的土壤中分离出的苍白杆菌属也被证明有此功能。随后的几年，人们又发现了副球菌属和假单胞菌属的一些菌种能以DMF为唯一碳源生长，并对它们进行了命名和酶学性质相关实验^[25-28]。其中，2010年Lukasz Dziewit发表的文章指出编码DMFase的酶在Paracoccus aminophilus JCM 7686 携带的质粒Plasmid pAMI2^[29]上。由此可见，目前对于生物法降解DMF的研究，主要停留在酶学方面，而从基因工程的方向研究其机制的课题并不多。而在此基础上，对基因进行改造以达到增加降解速率的相关研究几乎没有。

1.3 微生物降解DMF途径

微生物降解DMF同窗有两条途径。其一，先脱去两个甲基形成甲酰胺，在断开酰胺键形成。该途径目前被发现存主要存在于假单胞菌中。而副球菌、产碱杆菌、苍白杆菌以及部分假单胞菌^{[21, 30]}则采取第二条途径：先水解酰胺，形成二甲胺后，再分别脱去两个个甲基，生氨和甲酸。

图1-1 途径一，主要存在于假单胞菌中。

图1-2 途径二。更为普遍地出现在副球菌、产碱杆菌、苍白杆菌以及部分假单胞菌中

在查阅过相关文献后，我们发现尽管对于第二条途径的报道已经十分详尽，但关于第一条途径的研究却很少。在经过前期研究后，我们基本确定，铜绿假单胞菌的代谢途径以第一条为主。

1.4 本文的研究内容和目的

首先，在N,N-二甲基甲酰胺浓度不同的培养基中接种铜绿假单胞菌，以此确定其在DMF中的最适生长浓度。其次运用高效液相色谱法测定铜绿假单胞菌降解DMF的降解速率，为后续研究铜绿假单胞降解DMF的实验奠定基础。接下来，我们在对铜绿假单胞菌的基因组，利用测序的基因组构建铜绿假单胞菌的代谢网络，并通过代谢网络和生物信息学技术确定代谢途径及代谢相关酶。

第二章 DMF浓度对铜绿假单胞菌生长的影响

2.1 引言

微生物的生长受到环境中诸多因素的影响，如PH、温度、碳源、氮源及供氧等。因此，研究微生物生长的最适条件指导其在工业生产中的应用，使工业生产中对于微生物的使用更加合理、高效。

在本实验中，根据已查阅的资料，得知铜绿假单胞菌为专性需氧菌，最适生长约为30℃。而在前期实验中发现该菌对于水环境中PH的改变不大，主要维持在6.8~7左右。因此，对于铜绿假单胞菌最适生长条件的重点在于碳源的浓度对于其生长的影响，即培养基中DMF的浓度。由于DMF对生物体具有毒性，因此DMF的浓度对铜绿假单胞的生长有极大地影响。

2.2 材料与方法

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验用到的菌株

2.2.3 实验试剂

2.3 实验方法

2.3.1培养基及培养方法

2.3.1.1 培养基成分

用于活化铜绿假单胞菌的培养基为LB (g·L^-1)：酵母粉5，蛋白胨 10，氯化钠10。

用于测定Pseudomonas aeruginosa的最适生长条件的培养基为M9DMF (g·L^-1)：氯化铵 5，磷酸氢二钠 6， 磷酸二氢甲 3，氯化钠 0.5，PH调制7.4，灭菌（121℃ 15min）灭菌后加入2ml 1M 硫酸镁 和0.1ml 1M氯化钙。DMF浓度随实验要求改变, 在本章中分别设5、 10、 15、 20、 25 (g·L^-1)5个不同的浓度。

2.3.1.2 培养方法

铜绿假单胞菌培养方法：

菌种活化：无菌操作下，将甘油菌菌液接种至200 mlLB培养基中，在30℃恒温摇床内培养16 h。

菌种培养培养：无菌操作下，用移液器吸取200ul菌液，接入100 ml M9DMF培养基（500ml 摇瓶）中，在摇床上30 ℃恒温培养24 h，转速200 rpm。

2.3.1.3 铜绿假单胞菌最适生长DMF浓度曲线的绘制

将铜绿假单胞菌活化分别转接如DMF浓度分别为5、10、15、20、25 g/L 的M9DMF培养基中，30℃下培养24h。24h，72h，120h后，采用紫外分光光度计分别测量菌液的OD，以DMF浓度（g/L）为横坐标，菌液的OD图为纵坐标绘制图表。

2.4 实验结果与讨论

2.4.1不同DMF浓度培养基中铜绿假单胞菌的生长情况

根据实验所得数据，绘制出折线图，可以看出在DMF为10g/L左右时，铜绿假单胞菌的生长情况最好。

表2-1 该表为在DMF浓度为5、10、15、20、25g/L的情况性，培养基在24h、72h、120h后的OD值。

图2-1 由表1-1中数据绘出折线图。从图表中可见，铜绿假单胞菌在10g/L的培养基中OD最高，即生长情况最好。在低于10g/L时，铜绿假单胞菌的生长情况随浓度增加缓慢上涨；而在超过10g/L后，铜绿假单胞菌的生长情况迅速下降。此外，我们还可以看出，在不补充碳源的情况下，铜绿假单胞菌OD开始时上升，到3天以后会有衰退的情况。由此可见，铜绿假单胞菌的最适生长DMF浓度为10g/L，且在第三天的时候生长情况最好。

第三章 铜绿假单胞菌DMF降解速率的研究

3.1 引言

研究铜绿假单胞菌的降解机制包括了对铜绿假单胞菌胞菌DMF降解速率的测定，因为确定了其速率，我们一方面能验证铜绿假单胞确实具有降解DMF的功能，同时为后面研究DMF降解机制提供了基础，并且可以为铜绿假单胞菌降解DMF在工业生产中的运用提供了指导。在本实验中，我们使用高效液相色谱法测定培养基中DMF的浓度，并运用在不同时间点的DMF浓度，绘制出在OD大致稳定的情况下DMF的浓度变化图，以此计算出铜绿假单胞菌降解DMF的平均速率，观察降解速率的变化趋势。

3.2 材料与方法

3.2.1 实验仪器

3.2.2 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 构建HPLC测定培养基中DMF的方法

3.3.1.1 标品的制备

称取95%的DMF标准品100ul至于10 mL的容量瓶中，用去离子水定容，充分混匀，得到浓度为9.45g/L的DMF标准品母液。

3.3.1.2 DMF标准曲线的绘制

将标准母液稀释10倍后，在倍比稀释法分别稀释2、4、8、16、32 倍，最终浓度分别为0.04725、0.023625、0.0118125、0.00590625、0.002953125g/L的DMF标准溶液。

用高效液相色谱分别测定这些标品，确定出峰时间，并取有效值绘制DMF标准曲线图。（以浓度为横坐标（g/L）,峰面积为纵坐标）。

3.3.1.3 色谱条件

色谱柱：Lichrospher NH₂ (250 mm*4.6 mm,5 µm)；

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