竹黄菌固态与液态发酵产竹红菌素培养条件的研究毕业论文
2022-03-31 20:59:32
论文总字数：15176字
摘 要
液态发酵：将碳源，氮源，金属离子，pH等因素作为实验条件对竹黄菌进行培养。结果表明：竹红菌素最佳发酵碳源是3%的葡萄糖；最佳发酵氮源是0.4%的硝酸钠；最佳金属离子为0.02%的Mg2 ；最适pH为6。
固态发酵：秸秆等发酵基质，价格低廉，在农业生产中容易获得并且产地范围广阔，前景优越。用秸秆作为发酵基质是可以对竹黄菌进行固态发酵的，这让低成本生产竹红菌素成为了可能。从本文可得，用秸秆与玉米粉按比例混合后，可产出一定量的竹红菌素。但是，用秸秆发酵生产的竹红菌素的量比较低，我们可以继续探究这一发酵方法，优化发酵基质和发酵条件，来提高竹红菌素的产量。
关键词：竹黄菌 竹红菌素 液态发酵 固态发酵
Abstract
Liquid fermentation：The carbon source, nitrogen source, metal ions, pH and other factors as experimental conditions for cultivating tabasheer bacteria.The results show that the hypocrellins best carbon source is 3% glucose fermentation;The best fermentation sodium nitrate nitrogen source is 0.4%;The best metal ion of 0.02% magnesium 2 ;The optimal pH of 6.
Solid fermentation : Straw fermentation substrates, such as low cost, easy to obtain in the agricultural production and producing area wide, outlook is superior.Straw was used as fermentation substrates can be solid state fermentation of shiraia bambusicola bacteria, the low cost production of hypocrellins.From this article, after proportionally mixed with straw and corn flour, can produce a certain amount of hypocrellins.But with the amount of straw fermentation production of hypocrellins is lower, we can continue to explore this fermentation method, optimization of fermentation matrix and fermentation conditions, to increase the production of hypocrellins.
Key words: Shiraia bambusicola； Hypocrellins； Liquid fermentation； Solid fermentation
第一章 绪论
1.1 竹黄菌简介
竹黄菌(Shiraia bambusicola)是寄居生长于竹子之中的一种真菌[1,2]，绝大部分竹黄菌生长于我国南方地区，所谓竹黄主要是指竹黄菌的子座。绝大部分竹黄菌生长于我国南方地区（国外也有极少量的报道）。它是一种传统中药，在治疗跌打损伤和风湿性关节炎等病症方面有着显著疗效[3,4]，其大部分活性成分是竹红菌素，随着对其的更深层次探究以及医疗方面的效果，学者们深入研究后发现竹黄还可以较为有效地用来杀伤肿瘤细胞，抗病毒等[5,6]。
追溯至明朝时期，我国著名学者李时珍就将竹黄收录到其著作《本草纲目》中，书中特别提到竹黄可以润养内脏，清心明目甚至还可以用来治疗惊风等病症。很久以前，古代的人们就有用竹黄来治疗一些如头疼、胃疼等常见的疾病。
竹黄多产于我国南方地区，所以南方人民在很久以前就开始利用竹黄。每到其采摘季节，总有商人从南方地区收购竹黄并卖到北方。南方地区的人民经常将采摘的竹黄洗干净再切片，浸泡于米酒等酒类中酿制一段时间后，方可饮用，部分地区还用来入菜。
1.1.1 竹黄菌的分类
由于植物学家们对竹黄的分类依据不同，所以长久以来，竹黄菌的分类都不一致。最开始是由Hennings提出竹黄属命名这一概念的，并且把它划分在了子囊菌纲赤壳科[7]。又因为它有着比较大的肉座子囊果，所以Sacardo就把它划分为肉座菌目的肉座菌科[8]，大多数科学家认同了他的这种分类方法。Cheng等对它的ITS-5.8S r DNA和18S r DNA序列进行比对分析，并根据结果认为竹黄菌属于假球壳目Phaeosphaeriaceae科[9]。顾龙云等通过光学显微镜和电镜的观察使用，详尽的叙述了竹黄子座的生理结构和形态特征[10]。
1.1.2 竹黄菌的特征
竹黄菌是一种寄居生存的真菌，大部分寄生于我国特有的一种特殊的稀有竹类上，此类竹子主要产于长江下游地区，分布于安徽、江苏、浙江，植物学中称之为短穗竹。并且它绝大部分寄居生长于短穗竹及其变种上，而且有一定寄居环境要求：相同的培养面积中，它在干燥向阳环境中的寄生数量则比较少，但却在阴暗潮湿环境中的寄生数量比较多。其孢子在三月开始“发芽”，产生白色菌丝体变多结成块状并最后形成子座。此外，它亦可寄居生长于唐竹之上[11]。
竹黄子座质地较硬，从外表上观察，大多数为不规则的球形（也有少部分半球形），其上有孔洞和凸起，子座上还会残留有当时寄居生长于竹子时的痕迹，其表面颜色是红色，少部分表面吸附了一层白色菌丝体，让它的外表看起来像是灰褐色。其横断面较为光滑，通常呈是粉红色的扇形纹理，烘干后还会有特殊香气，味道稍苦。其子囊壳在其子座的边缘上，有6或8个线形分布的子囊孢子，它在未成熟时呈无色，成熟后呈桔黄色。
实验表明竹黄菌是可以在Potato Dextrose Agar平板上（或斜面）生长的。观察它的菌落，在早期的时候，呈松散的絮状，后期则逐渐呈现出绒状。因为竹红菌素可以分泌到细胞的外部，故而当其与菌落接触的培养基反面就会呈现出红色。培养4天左右时间时菌丝体才开始渐渐产生色素，菌落中间呈现出红色。
1.1.3 竹黄的成分及生长环境问题
除了竹红红菌素以外，竹黄还含有如头孢素、硬脂酸、甘露醇等多种生物活性成分。王凤芳等[12]研究了制成干品的竹黄里甘露醇、蛋白质、还原糖、脂肪等含量的检测，研究的结果表明甘露醇含量最高，含量是6.7%。特别说明的是，不同产地竹黄各组成成分的含量差别也不小，比如李聪等[13]检测到甘露醇的含量甚至不足2%，与之前所提到的王凤芳的研究结果相比，出入很大。张梁等[15]使用竹黄进行液态发酵，功夫不负有心人，最终首次从微生物发酵液中提取并获得了这种物质：1,5-二羟基-3-甲氧基-7-甲基蒽醌，该物质具有继续深入探究并研发的价值以及广阔前景。项晓燕[14] 在其液态发酵的过程中运用气像色谱-质谱联用仪对挥发性成分进行了更深层次地探究，发现了三种挥发性的组分。经过鉴定后发现，都是脂肪族化合物。另外通过比对，我们发现，关于脂肪族化合物的含量，人工发酵所得到的含量要比野生自然发酵后的含量要多得多。
随着日益严重的环境污染问题，适合的竹黄菌可生长环境变得愈发稀少起来，特别是人们过度采摘野生竹黄，使其本就不多的产量逐年下降。所以为了等到我们完全开发出竹黄菌的作用以及价值后，能够可以在将来更好的使用开发并持续发展他在不同领域的作用，我们应该努力去保护竹黄菌的生长环境。
1.2 竹红菌素
1.2.1 简介
竹黄中的主要活性成分是竹红菌素，最初是在竹红菌子座中被发现的，是由多种苝醌类化合物混合而成[16]。竹黄中含有四种竹红菌素，但是他们的总量只占子座重量的0.4%。除了竹黄和竹红菌以外，菌寄生菌属也可以合成竹红菌素。发现竹红菌甲素不久后，Chen等就开始对它的结构进行了分析[17]；万象义等通过分离竹红菌从而得到竹红菌乙素，还发现使用酸（或者碱）作为催化剂可以让竹红菌甲素通过化学变化到竹红菌乙素[18]。依次类推，竹红菌中还含有另外两种含量不高的组分，命名为竹红菌丙素和竹红菌丁素[19,20]。
竹红菌素中含量最高的组成成分是竹红菌甲素，它是红色晶体，它的溶解性为：难以溶于水，却极易溶于有机醇溶液。竹红菌素在可见光区的吸收峰不随浓度改变而变化，证明竹红菌素在高浓度下也比较稳定，较之同类的的血卟啉衍生物具有很大优势[21]。试验中发现用乙醇溶解的竹红菌素溶液遇到中性或者酸性溶液时颜色会变为红色，但是遇到碱性溶液时颜色又变为深绿色，所以我们可以通过他这个很明显的显色反应的性质开发出一种由竹红菌素作为主要组成成分的新型酸碱指示剂。此外，它能可以与氯化铁发生反应，溶液颜色由之前的红色转变为紫色。
1.2.3 竹红菌素的药用价值
竹红菌素是一种在光照条件下可以通过电子转移形成负离子自由基的光敏化合物[22]。负离子自由基会破坏DNA的结构，诱导生物体内的细胞死亡或者使酶失去活性而导致死亡，对生物体内的活性生物杀伤力极强[23-25]。所以竹红菌素拥有这一能力对肿瘤细胞进行有效地杀伤，从而抑制肿瘤细胞，同理竹红菌素对HIV病毒的快速繁殖也有抑制效果从而使患者病情稳定[26]。
通过研究我们还鉴定出竹红菌素还可以有效地抑制枯草芽孢杆菌[27]。特别是在不同的光源和波长的情况下，它的抑制活性有着不同的变化，可以通过制作图表来探寻具体的线性关系[28,29]。研究表明竹红菌素对革兰氏阳性菌、黑曲霉和白地霉等霉菌有着较为明显的抑制效果[30]。通过一系列的实验，动物学家们还发现竹红菌素在对动物等镇痛方面有着显著作用[31,32]，可以进一步进行深入探究以寻求为何在镇痛等医疗方面有显著疗效。特别是古代人们就发现了使用水浸泡竹黄后，其水溶液可以起到局部麻醉剂的效果[33]。之前我们提到了竹红菌素因光使电子形成负离子，从而有效抑制甚至损伤生物大分子，这就为他在抗癌抗肿瘤领域提供了假设的可能，通过科学家发现的竹红菌素抗癌原理研究说明了，竹红菌素能光敏损伤人盲肠癌等一系列的癌症细胞，从而对很多棘手的肿瘤和癌细胞进行抑制与消灭[34,35]。
1.2.4 竹红菌素的合成
竹红菌素可以通过化学法和生物法合成。付滨等曾通过12步复杂的化学反应将竹红菌素从3，5-二羟基苯甲酸中提取出来，但是这种合成法操作复杂，步骤较多，生产成本偏高，大量制备不是很现实[36]，所以我们主要对生物法合成竹红菌素进行研究。虽然能够产生苝醌类的化合物的真菌非常多，但是生物学以及化学一直进步发展到现在，我们实际操作中依然只能用竹黄菌来提取出少量的竹红菌素，并且不管是是固液态的哪种发酵方法，生产出的竹红菌素产量依然不可观，所以根本不可能实现成规模地产业化生产。而且由于竹红菌含量的表述方法有多种，没有统一的标准，使得我们对竹黄菌固液态发酵生产竹红菌素的继续深入探究变得举步维艰。
使用发酵的方式来进行人工培养竹黄菌时，培养基中常常会混入竹汁以及别的天然成分，而且不管是哪种发酵方法生产竹红菌素，都要尽可能地保持培养基的温度在27℃左右。张灏[37]等选取到了一株可以产竹红菌素的菌株，并且利用优化后的培养基（改进了培养基组分）进行竹黄菌的液态发酵，培养一周后，竹红菌素的提取率达到了1.7%。
第二章 竹黄菌液态发酵生产竹红菌素
2.1 菌种
竹黄菌取自本实验室的实验人员自己采摘，并经过分离培养后，通过中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，并获得保藏号为CGMCC NO.11617的一株竹黄菌株。
2.2 试剂、设备
该实验过程中用到的实验试剂：牛肉膏，Hypocrellins A，玉米粉，C2H5OH，无水硫酸镁，磷酸二氢钾，土豆淀粉，C6H12O6，六水合三氯化铬，Potato Dextrose Agar。
该实验过程中用到的实验仪器：超净台，灭菌锅，离心机，天平，烘箱，霉菌培养箱，紫外可见分光光度计。
2.3 培养基
2.3.1 液体种子培养基（%）
pH正常，C6H12O6 2，无水硫酸镁 0.05，磷酸二氢钾0.1，牛肉膏 0.3。
2.3.2 液态发酵培养基
pH正常，无水硫酸镁 0.05，磷酸二氢钾 0.1，硝酸钠 0.3，C6H12O6 2，土豆淀粉0.5。
2.3.3 斜面培养基
按实验室已有的Potato Dextrose Agar粉末配制培养基，做成斜面。
2.4 试验方法
用0.9%的生理盐水多次冲洗斜面种子，并重新收集加入液体种子培养基中（建议该培养基加入玻璃珠，使之培养均匀），再安置在摇床中，设定恒温 26℃，转速120r/min培养，培养两天后，加入液态发酵培养基中，再次设定恒温，26℃，150 r/min, 培养一周时间。
2.4.1 碳源及碳源浓度对竹黄菌液体发酵的影响
除基本培养基外，将2％的各供试碳源(C12H22O11、乳糖、C6H12O6，果糖以及可溶性淀粉)加入，温度设定为26℃，转速为150 rpm的培养箱中培养6天，每种测定平行做三个为一组，再分别测定，取其平均值，并记录结果。
选出培养最好的一组，分别加入此碳源2％、3％、4％，每组仍然做三个相同的平行实验，同种条件下进行培养后，再分别测定，取其平均值并记录结果。
2.4.2 氮源及氮源浓度对竹黄菌液体发酵的影响
除去基本培养基，将0.3%的供试氮源（(NH4)2SO4，NH4NO3、蛋白胨、牛肉膏和酵母膏）加入，温度设定为26℃，转速设定为l50 rpm的培养箱中培养，每天分别测量生物量，持续5天，每组测定依然是做三个平行，再分别测定，取其平均值，并记录结果。
选出培养最好的一组，依次加入此碳源0.3％、0.4％、0.5％，每组依然做三个相同平行实验，同种条件下进行培养，再分别测定，取其平均值并记录结果。
2.4.3 金属离子及金属离子浓度对竹黄菌液态发酵的影响
除去液态基本培养基外，将的2%的氯化铬、氯化钙、硫酸锰、硫酸镁、硫酸铜分别加入液态发酵培养基中。放于温度设定为26℃、转速设定为150 rpm培养箱中培养6天，每一组做三个平行实验，再分别测定色素产量和生物量，取其平均值并记录结果。
选出培养得最优金属离子后，选取其1%，2%，3%的三个浓度梯度，也是每个梯度做三个一样的，即平行实验，相同条件下培养6天后测定生物量和色素产量，取其平均值并记录结果。
2.4.4 pH对竹黄菌液态发酵的影响
各取1 mol/L的氯化氢和氢氧化钾加入液态基本培养基中，分别调节pH至4，5，6，7，8，9。放于温度设定为26℃、转速设定为150 rpm的培养箱中培养6天，每组做三个平行实验，测定其色素产量和生物量，取其平均值并记录结果。
2.5 分析方法
2.5.1 生物量（细胞干重）测定
先用布氏漏斗抽滤发酵液，再用蒸馏水洗涤，最后将菌丝体放入烘箱中烘干。当水分完全蒸发后进行称重。
2.5.2 竹红菌素含量的测定
将一定量完全烘干的菌丝体与C2H5OH混合，静置一天，过滤（个别过于稠的可以考虑使用离心机），得到清澈透明的提取液，用C2H5OH稀释后测定其吸光度，最后利用回归方程计算Hypocrellins A的含量。
将无菌丝体的发酵液与以C2H5OH按1:1浓度混合，放置一天，再用抽滤除去溶剂，再用C2H5OH定容到相同刻度，测定其吸光度（464nm）。
2.6 结果与分析
2.6.1 碳源对竹黄菌液态发酵的影响
表1 不同碳源对生物量的影响
从表1得出结论，可溶性淀粉和葡萄糖作为碳源时，菌丝体的生长比其他三种要好不少，蔗糖作为碳源产生的菌丝体很少。而且葡萄糖的价格比可溶性淀粉的价格低很多，所以我们认为葡萄糖是最适碳源。
确定葡萄糖是最适碳源以后，开始研究不同浓度的葡萄糖对发酵的影响。当葡萄糖浓度为2%，3%，4%时，其5-9天的生物量变化情况如图2所示。
表2 不同浓度葡萄糖对生物量的影响
从表2看出，当葡萄糖浓度为3%时，菌丝体明显多于其他两个浓度。所以我们认为葡萄糖的浓度为3%时是最适碳源浓度。
2.6.2 氮源对竹黄菌液态发酵的影响
表3 不同氮源对生物量的影响
从表3得出结论，硝酸钠作为氮源时，菌丝体生长比其他种类氮源优秀很多，硫酸铵中的菌丝体量最少，所以我们认为硝酸钠是最适氮源。
确定硝酸钠是最适氮源后，进一步研究了不同氮源浓度对液态发酵的影响。当硝酸钠浓度为0.3%，0.4%，0.5%时，它培养5，6,7,8，9天时生物量的变化如表4所示。
表4 不同浓度硝酸钠对生物量的影响
观察表4可以得出，当硝酸钠的浓度为0.4%时，菌丝体的量明显多于其他两种浓度。所以我们认为当硝酸钠的浓度为4%时是最适氮源浓度。
2.6.3 金属离子及金属离子浓度对竹黄菌液态发酵的影响
表5 金属离子对生物量和色素产量的影响
通过表5可得，加入Mn2 、Ca2 、Mg2 后，生物量与吸光度都比不加任何东西的空白组好，添加Cu2 、Gr3 后，生物量基本不变，没有明显的帮助。说明Mn2 、Ca2 、Mg2 三种离子可以促进菌体的生长发育以及分泌色素。特别是加入Mg2 后，生物量和色素量较其他种类离子相比明显提升，得以确定Mg2 是竹黄菌液态发酵的最适金属离子。
确定了Mg2 是最适金属离子后，开始研究Mg2 离子浓度变化对液态发酵的影响。将Mg2 浓度分别按照0.01%，0.02%，0.03%进行对比实验，记录其生物量与吸光度情况，如表6所示。
表6 不同浓度Mg2 对生物量和色素产量的影响
通过表6我们大致看到，Mg2 在三种浓度时对菌体的生长和色素产量都有良好的促进，Mg2 浓度为0.02%时促进效果最佳。所以我们认为Mg2 最适离子浓度为0.02%。
2.6.4 pH对竹黄菌液态发酵的影响
表7不同浓度pH对生物量和色素产量的影响
观察表7可得，pH值为7时生物量最高，pH值为6时竹红菌素的含量最高，发现pH过高或者过低时，明显抑制色素的产生。所以我们认为pH的最适值为6。
第三章 竹黄菌固态发酵生产竹红菌素
3.1 菌种
竹黄菌取自本实验室的实验人员自己采摘，并经过分离培养后，通过中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，并获得保藏号为CGMCC NO.11617的一株竹黄菌株。
3.2 试剂、设备
本实验所用的实验试剂有：牛肉膏，玉米粉，Hypocrellins A，磷酸二氢钾，C2H5OH，硫酸镁，氯化铁，C6H12O6，六水合三氯化铬，Potato Dextrose Agar。
本实验所用的仪器有：灭菌锅，霉菌培养箱，超净台，烘箱，紫外可见分光光度计，食品加工机，天平，离心机。
3.3 秸秆的处理
3.3.1主要培养基料
玉米秆，石膏，野草，少量豆粕以及鸡粪牛粪等。
3.3.2 培养基料的发酵处理
预处理：将野草和玉米秆切成20cm左右长度，与粪便进行混合，配比为1:1:0.67，混合均匀并进行预湿处理直至含水量为80%左右停止，将其密封放置2天。
添加辅料：将石膏与野草按0.16:1,豆粕与石膏按1:2.4比例称取，于料堆上搅匀，即所得发酵料堆。
一次发酵：将发酵料堆放入一次发酵隧道中，升高温度到75℃，保温4天，然后降温，期间多次翻堆，最后得到培养料的含水量为70%-75%。
二次发酵：将所得培养料转入二次发酵隧道内，微生物发酵至巴氏杀菌温度58-60℃，保温10小时后，进行5天的腐熟，所得培养基料的含水量为68%左右。
3.4 培养基
3.4.1 斜面培养基
采用实验室已有的Potato Dextrose Agar培养基粉末，按说明配制，制成斜面。
3.4.2 液体种子培养基（%）
pH正常，牛肉膏 0.3，C6H12O6 2，磷酸二氢钾 0.1，硫酸镁 0.05。
3.4.3 固态发酵培养基
将石膏，粪便，玉米杆以及野草等发酵的秸秆基料与纯玉米粉按一定比例配置成纯秸秆基料。保持培养基的含水量为68%，配制好后。均匀放入培养平板中，放入高温高压灭菌锅，设定温度121℃，灭菌时间为15min，完成后待其冷却，再加入液体种子。
将玉米秆，粪便，野草和石膏等发酵的秸秆基料与Fe3 ，玉米粉分别按一定比例配成纯秸秆基料，保持培养基的含水量为60%-70%，配制好后，均匀放入培养平板中，放入高温高压灭菌锅，设定温度121℃，灭菌时间为15min，完成后待其冷却，再加入液体种子。
3.5 试验过程及培养条件
用0.9%的生理盐水多次冲洗斜面种子，并重新收集加入液体种子培养基中（建议该培养基加入玻璃珠，使之培养均匀），再安置在摇床中，设定恒温 26℃，转速120r/min培养，培养两天后。每个平板中接入等量的种子液，接入量定为100μl，放入培养箱中培养，恒温26℃培养8天后取样，之后在第9，第10，第11，第12，第13天相同时间
3.6 分析方法
3.6.1 竹红菌素标准曲线的测定
称取Hypocrellins A标品3.6mg，并放入10ml容量瓶中，用C2H5OH溶解定容，得到标准品溶液浓度为0.36mg/ml，加入C2H5OH稀释成下列浓度（10，20，30，50，100，120，180，240，单位：μg/ml），测量这批标品溶液的吸光度（464nm处），按照Hypocrellins A浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，进行计算，得到其标准回归方程为y=0.0403x-0.0283，R²=0.9997 。
3.6.2 竹红菌素含量的测定
把固态培养基放入烘箱干燥，粉碎，取0.1g与50ml C2H5OH混合，搅拌并放置两个小时，取浸提液离心，取上层清液，得到澄清的色素液，用C2H5OH稀释若干倍之后，测量波长为464nm时的吸收度（用分光光度计），再利用标准回归方程计算Hypocrellins A的含量。测量连续六天的读数，计算平均值，记录结果。
3.7 结果与分析
3.7.1 结果
秸秆与玉米粉不同比例混合，竹黄菌发酵产生竹红菌素的量如图8所示
表8不同比例秸秆与玉米粉混合发酵竹黄菌得到竹红菌素的含量
①纯秸秆 ②纯玉米粉 ③秸秆：玉米粉=1；1 ④秸秆：玉米粉=2:1 ⑤秸秆：玉米粉
3.7.2 分析
由表中可以看出，竹黄菌是能在秸秆上生长的，只是所产的竹红菌素较低（大约为4mg/ml），而经过与玉米粉进行混合后，竹黄菌在混合固态培养基中可以产出可观的竹红菌素。
3.8 结论与讨论
秸秆等发酵基质，价格低廉，在农业生产中容易获得并且产地范围广阔，前景优越。用秸秆作为发酵基质是可以对竹黄菌进行固态发酵的，这让低成本生产竹红菌素成为了可能。从本文可得，用秸秆与玉米粉按比例混合后，可产出一定量的竹红菌素。但是，用秸秆发酵生产的竹红菌素的量比较低，我们可以继续探究这一发酵方法，优化发酵基质和发酵条件，来提高竹红菌素的产量。
总结与结语
液态发酵：竹红菌素最佳发酵碳源是3%的葡萄糖；最佳发酵氮源是0.4%的硝酸钠；最佳金属离子为0.01%的Mg2 ；最适pH为6。
固态发酵：秸秆等发酵基质，价格低廉，在农业生产中容易获得并且产地范围广阔，前景优越。用秸秆作为发酵基质是可以对竹黄菌进行固态发酵的，这让低成本生产竹红菌素成为了可能。从本文可得，用秸秆与玉米粉按比例混合后，可产出一定量的竹红菌素。但是，用秸秆发酵生产的竹红菌素的量比较低，我们可以继续探究这一发酵方法，优化发酵基质和发酵条件，来提高竹红菌素的产量。
参考文献
1 卢济台,刘圣荣,真菌竹黄的生药学研究[J].中药通报,1981，6(6): 7-8
2 刘波.中国药用真菌[M].太原:山西人民出版社,1978. 9-14
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