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摘 要

雷公藤甲素是从中国传统中药—雷公藤中分离出的雷公藤提取物的一种，它是雷公藤提取物中主要的活性成分和有效物质。一方面，雷公藤甲素由于其强有力的免疫抑制和抗炎、抗肿瘤作用而备受关注。另一方面，由于其毒性，尤其是对雄性的生殖毒性，极大限制了雷公藤甲素临床的应用。本实验以小鼠睾丸组织为研究对象，就雷公藤甲素对小鼠睾丸组织造成的损伤，以及分子机制进行研究。研究包括：①小鼠睾丸指数的测量；②检测小鼠睾丸组织中琥珀酸脱氢酶以及丙二醛的活化程度等生化指标；③小鼠睾丸组织的TUNEL染色；④小鼠睾丸组织的HE染色。分子机制研究包括：①小鼠睾丸组织中caspase-3的活化程度的检测；②免疫组化法检测小鼠睾丸组织中p-JNK的表达量。结果显示：雷公藤甲素的干预会导致小鼠的睾丸重量／体重比值明显下降，形态学研究显示雷公藤甲素对小鼠生殖细胞形态有显著影响。通过对琥珀酸脱氢酶和丙二醛的含量检测发现，雷公藤甲素影响小鼠睾丸细胞的能量循环，造成氧化损伤。TUNEL实验进一步证实，雷公藤甲素诱导细胞DNA断裂，细胞发生明显凋亡。分子机制研究显示：雷公藤甲素可使小鼠睾丸组织内caspase-3显著上调，通过激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡。同时还可以上调p-JNK的表达，激活JNK通路，诱导细胞凋亡。为深入研究雷公藤甲素的生殖毒性，毒理机制，扩大其临床应用以及新药的开发提供理论依据。

关键词：雷公藤甲素(TP) 生殖毒性 细胞凋亡

Mechanisms of triptolide-induced testicular injury in mice studies

ABSTRACT

Triptolide is the main active ingredient of traditional Chinese traditional medicine, Tripterygium wilfordii. It has not only strong anti-inflammatory, immunosuppressive effects, but also powerful anti-tumor effects, which is of great value in pharmaceutical research. But its toxicity, especially the male reproductive toxicity, leads to great limitation of the clinical application. In the current study, triptolide – induced testicular injury model of mice was established. Then the model was evaluated based on the testis index, succinate dehydrogenase and malondialdehyde in testis, as well as TUNEL and Hamp;E staining. Finally, the expression levels of caspase-3 and p-JNK in testicular tissue were detected in order to clarify the underlying toxicological mechanism of Triptolide. The results showed that triptolide could not only up-regulate caspase-3 in mouse testis and activate mitochondrial apoptosis pathway, but also up-regulate the expression of p-JNK and activate JNK pathway, simultaneously resulting in testicular cell apoptosis. Fragmentation of testicular cell DNA was induced, and the energy cycle was affected, eventually resulting in significant testicular damage. This study provides a theoretical basis for further study on the toxicity of triptolide and its mechanism, so as to lay foundations for its clinical application.

Key Words: Triptolide Reproductive toxicity Apoptosis

目录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

第二章 器材与方法 4

2.1 实验动物及体内实验 4

2.2 睾丸组织中琥珀酸脱氢酶（SDH）、丙二醛（MDA）以及半胱天冬酶-3 (caspase-3)的活化程度等生化指标的检测。 4

2.3 睾丸形态学分析 4

2.4 TUNEL染色 5

2.5 免疫组化 5

2.6 数据分析 5

第三章 结果与讨论 7

3.1 睾丸指标的检测 7

3.2 睾丸组织中琥珀酸脱氢酶（SDH）、丙二醛（MDA）以及半胱天冬酶-3（Caspase-3）的活化程度等生化指标的检测。 8

3.3 睾丸形态学分析 9

3.4 TUNEL染色 10

3.5 免疫组化 11

第四章 结论与展望 13

4.1 结论 13

4.2 展望 14

参考文献 15

致谢 17

第一章 文献综述

1.1 前言

雷公藤（Tripterygium wilfordii）是我国拥有的一种历史悠久的药用植物，为卫矛科雷公藤属。雷公藤甲素（Triptolide，TP），又称雷公藤内酯、雷公藤内酯醇，为雷公藤的主要活性成分之一,也是雷公藤制剂的主要有效成分^[1]。现代药理学研究表明雷公藤在抗炎、免疫调节、抗肿瘤方面有着其独特的治疗效果及应用前景^[2]。虽然雷公藤在疗效方面备受现代医学的关注，但是由于它的毒副作用，雷公藤甲素在临床方面的应用受到了极大的限制，其中雷公藤甲素对生殖功能的损害更是不可小觑 ^{[ 3- 4]}。雷公藤多苷在经大鼠灌胃后在体内快速分布，在心、肝、脾、肺、肾等组织，并快速地通过代谢消除，体内没有蓄积，并且具有较高的生物利用度^[5]，其对睾丸生精功能、附睾精子成熟、受精以及内生殖分泌均有一定程度的负面影响^[6]。有研究证明了雷公藤甲素在低浓度时即可对生精细胞有抑制作用^[7]。李凡、彭戈峰^[8]发现雷公藤甲素可以引起附睾功能损伤，继而影响附睾尾精子运动速率和线性方向。Liu的研究表明^[9]，当大鼠被雷公藤甲素干预28天后，大鼠睾丸出现附睾管内成熟精子缺乏以及生精细胞坏死以及剥离等症状。张俊鹏、张宝婵，李瑞明^[10]等指出雷公藤甲素灌胃可使大鼠睾丸、附睾脏体指数明显降低。可见雷公藤甲素毒性作用机制与抑制睾丸中雄激素受体表达有关。

现有文献多与雷公藤甲素对大鼠或小鼠睾丸的损伤及其所产生影响相关,而具体探讨损伤的产生机制的文献很少。通过探讨多个与小鼠睾丸损伤相关的指标在雷公藤给药前后的变化，以推测雷公藤甲素诱导小鼠睾丸损伤的机制，这将是本实验所需要研究的重点。本研究拟通过雷公藤甲素对小鼠的腹腔注射干预，建立小鼠睾丸损伤模型并由此探讨可能的损伤机制。

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