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摘 要

本实验通过一步克隆方法将葡聚糖蔗糖酶基因片段与pET-28a质粒连接构建重组质粒，并导入到大肠杆菌中。对重组大肠杆菌产葡聚糖蔗糖酶的温度、诱导剂浓度及诱导时间的条件进行优化，探究得到葡聚糖蔗糖酶催化蔗糖产葡聚糖的最适pH、最适温度、最适离子条件。实验结果表明，重组后的大肠杆菌能够稳定生长并成功表达葡聚糖蔗糖酶，在25℃，诱导剂浓度为0.5 mM时重组大肠杆菌生长和产酶性能最优。在pH为5.5，温度为35℃，含有Ca² 的条件下葡聚糖蔗糖酶催化效果最好。

关键词：重组大肠杆菌 葡聚糖蔗糖酶 葡聚糖

Study on Enzymatic Properties of Recombinant Escherichia coli Glucan Sucrose Enzyme and Structure Identification of Catalytic Synthesis of Dextran

ABSTRACT

In this study, the dextran sucrase gene fragment was ligated with pET-28a plasmid by one-step cloning method and introduced into E. coli. The conditions for the temperature, inducer concentration and induction time of the recombinant Escherichia coli glucanase were optimized. The optimum pH, optimum temperature and optimumion conditions were obtained from the dextran sucrase catalyzed by dextran. The results showed that the recombinant Escherichia coli could grow stably and successfully express dextran sucrosease. The recombinant Escherichia coli was optimized at 25℃ and the inducer concentration was 0.5mM. The catalytic effect of dextran sucrase was the best at pH 5.5, temperature 35℃ and Ca² .

Key words ：recombinant E. coli dextran sucrose dextran

目 录

摘要 Ⅰ

ABSTRACT Ⅱ

第一章 绪论 3

1.1 前言 3

1.2 葡聚糖的生产 4

1.3 本论文的研究目的及内容 5

第二章 产酶条件优化 6

2.1 实验仪器与实验试剂 6

2.1.1 实验仪器 6

2.1.2 实验试剂 6

2.2 实验方法 7

2.2.1 实验试剂的配制 7

2.2.2 工程菌BL21/pET28a-Dsr1348种子液摇瓶发酵 7

2.2.3 酶活测定 8

2.3 实验结果与讨论 9

2.3.1 果糖标准曲线的测定和绘制 9

2.3.2 诱导阶段温度对产酶的影响 9

2.4 本章小结 11

第三章 酶催化条件优化 12

3.1 实验仪器与实验试剂 12

3.1.1 实验仪器 12

3.1.2 实验试剂 12

3.2实验方法 12

3.2.1 实验试剂的配制 12

3.2.1 工程菌BL21/ pET28a-Dsr1348种子液摇瓶发酵 13

3.2.2 酶催化阶段pH对酶催化的影响 13

3.2.3 酶催化阶段温度对酶催化的影响 13

3.2.4 酶催化阶段金属离子对酶催化的影响 13

3.3 实验结果与讨论 13

3.3.1 pH对酶催化的影响 13

3.3.2 温度对酶催化的影响 14

3.3.3 金属离子对酶催化的影响 15

3.4 本章小结 16

第四章 对生成的产物进行鉴定分析 17

4.1 傅里叶红外光谱表征 17

4.2 核磁共振图谱表征 17

4.3 本章小结 19

第五章 结语与展望 20

5.1 结语 20

5.2 展望 20

参考文献 21

致 谢 24

第一章 绪论

1.1 前言

葡聚糖（Glucan）是一种高分子聚合物，其组成单位为葡萄糖。一般情况下，葡聚糖可以根据构型的不同分为两种，即α型和β型。淀粉属于α型葡聚糖，其主要作用是供能。β(1-3)-D、β(1-4)-D等葡聚糖组成β型葡聚糖，与α型葡聚糖相比其可以降低血糖血脂，具有免疫调节、抗敏消炎、细胞修复等作用。

葡聚糖不仅对食品行业具有重要的意义，同时在制药、医疗、化工等行业中也有十分重要的应用^[1]。葡聚糖的主链中主要具有α（1-6）连接的D-吡喃葡萄糖的细胞外细菌聚合物，并且含有可变量的α（1-2），α（1-3），α（1-4）支链^[2-4]。葡聚糖是细菌多糖，可用作药物，特别是作为血浆容量膨胀剂^[5]。同时葡聚糖在制药，食品及化学工业中作为佐剂、载体、乳化剂及稳定剂具有重要的工业应用^[6]。在食品加工的过程中，葡聚糖可以作为增稠剂使用，以提高果酱和冰激凌的粘稠度，使其口感更佳，同时葡聚糖也可作为食品的稳定剂使用^[7]。它具有防止结晶糖，提高保湿性，维持风味和各种食品^[8-10]的外观的作用，可作为食品添加剂使用，如以葡聚糖为原料生产的的粘合剂、食品添加剂等。目前使用较多的粘合剂为化学粘合剂，其在使用过程中会释放挥发性极强、刺激性极大的有毒有害气体，如甲醛等，这些有毒有害气体会危害人体的健康。有些化学粘合剂在体内不容易降解，毒副作用较大，对人体具有较大的危害。但是以葡聚糖为原料的生物粘合剂可以在体内降解并排除体外，对身体无毒副作用，且稳定性较高。葡聚糖制作而成的生物粘合剂可以对内脏器官伤口、骨骼、牙齿等进行粘合。人体内部器官进行缝合手术时可采用以葡聚糖为原料的粘合剂，省去了缝合后的拆线的过程，伤口在愈合的同时以葡聚糖为原料粘合剂会被人体降解排出体外，不会增加身体的负担，有利于人体健康。交联葡聚糖对蛋白质的分离和纯化具有重要的意义，其主要功能为分子筛作用，在多肽分离，清洗生物提取液、分子量测定、脱盐等操作过程应用非常广泛。

1.2 葡聚糖的生产

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