论文总字数：16469字

摘 要

微生物反硝化作用对降低氮污染、控制腹肌营养化具有重要作用。而污水中大多盐浓度比较高，对于反硝化菌的反硝化作用又是一种抑制。本论文通过采点取样、菌种筛选、脱氮性能测定等一系列实验，先从定点环境中筛选出了耐盐型反硝化菌，又通过提升盐浓度来进一步筛选其盐浓度的耐受性，并从其中挑选出形态不同、生长状态良好的菌种进行进一步的测试。经过测试比较从中挑出了脱氮能力最优的几株，对其16s rDNA进行检测来鉴别菌种属，并对其反应动力学也进行了检测，为以后耐盐反硝化菌的取样地点，筛选分离方法等都有一定的参考价值。

关键词：耐盐；反硝化菌；分离；脱氮性能研究

Study on the Separation and Performance of Salt-tolerant Denitrifying Bacteria in Typical Environment

Abstract

Denitrification is very useful for our natural environment and is a very important part of the nitrogen cycle. Denitrifying bacteria can denitrify the nitrogen and carbon sources in the wastewater. However, most of the salt concentration in the sewage is relatively high, and the denitrification of denitrifying bacteria is also a kind of inhibition. In this dissertation, a series of experiments, such as point sampling, strain screening, and denitrification performance, were carried out. First, the salt-tolerant denitrifying bacteria were screened out from the fixed environment, and salt tolerance was further screened by increasing the salt concentration. From there, strains of different morphology and good growth status were selected for further testing.After testing and comparing, several strains with the best denitrification capacity were selected. The 16s rDNA was tested to identify strains and their reaction kinetics were also tested.Therefore, For future sampling sites of salt-tolerant denitrifiers, screening methods, etc. have a certain reference value, also pick out high-performance strains to facilitate the subsequent experimental operation,this topic is of great significance to the severe pollution of today's society.

Key words：Salt tolerance；Denitrifying bacteria；Separation；Denitrification performance

目 录

摘 要 I

Abstract ..II

第一章 文献综述 1

1.1 前言 1

1.2 硝酸盐然的危害 1

1.3 反硝化过程基理 1

1.4 反硝化、反硝化耐盐研究进展 2

1.5 研究目的和意义 3

第二章 实验部分 4

2.1 实验试剂与仪器 4

2.1.1实验试剂.........................................................................................................................4

2.1.2实验仪器.........................................................................................................................5

2.2 实验方法 6

2.2.1 样品采集 6

2.2.2 试剂配制 6

2.2.3 反硝化耐盐菌的分离 8

2.2.4 反硝化耐盐菌脱氮能力测定.......................................................................................8

2.2.5 反硝化耐盐菌的挑选和鉴定.....................................................................................10

2.2.6 高性能反硝化耐盐菌的动力学特征.........................................................................10

第三章 实验结果与讨论 11

3.1 反硝化耐盐菌总氮脱氮性能 11

3.2 反硝化耐盐菌硝酸盐氮脱氮性能 14

3.3 反硝化耐盐菌的鉴定 16

第四章 结论与展望 18

4.1 结论 18

4.2 展望 18

参考文献 19

致谢 21

附录.........................................................................................................................22

第一章 文献综述

1.1 前言

随着经济的不断发展和能源消耗的不断加剧，全球的氮氧化合物排放量不断增加。逐步增长的氮氧化物浓度逐渐成为一个严重的环境问题，而且对公众健康构成潜在风险。氮氧化物的种类较多，包括一氧化二氮(NO)、氧化二氮(N₂O)、二氧化氮(NO₂)、四氧化二氮(N₂O₄)、五氧化二氮(N₂O₅)等多种形式。硝酸盐是含氮有机物经过无机分解的终产物，也是环境中含氮化合物形式里最稳定的化合物，所以环境中硝酸盐含量很多。

1.2 硝酸盐污染的危害

硝酸盐是一种极易被生物体吸收的化合物，也容易被排泄出去，大多时候对我们不构成什么危害。但是当在环境中缺少氧气的情况下，就可能产生意想不到的后果，比如硝酸盐会在缺氧的消化道里被还原成亚硝酸盐，而亚硝酸盐是一种有毒的化合物，它在人体内会将低铁红蛋白氧化，生成高铁红蛋白，进而导致红细胞失去运输氧气的能力；而且，亚硝酸盐还能与体内的伯胺类化合物发生反应生成亚硝胺类化合物，这是一种可致癌的物质。所以如果经常和硝酸盐浓度超标的水，就会使人中毒，甚至出现其他症状，如高血压、甲状腺肿、胃癌、甲状腺疾病和出生缺陷。在动物中，可能会导致肌肉无力和腹痛^[1-2]。世界卫生组织规定，人类摄入硝酸根浓度限度为10毫克每升，而动物为100毫克每升。形势严峻，所以氮氧化物的处理成为一个重要的研究点。

因为硝酸盐极易溶于水，所以水源是硝酸盐污染的主要方式，地下水中硝酸盐是一种主要的污染物质，分布范围广而且在不断增加。居民生活产生的污水、垃圾、粪便，农田施用大量化肥、使用污水灌溉农田、工业废水不经处理肆意排放等^[3]是地下水中大量硝酸盐氮的主要来源方式。而我们的饮用水又大多来自地下水的供给。饮用水中生物硝酸盐的去除首先于1981年在法国城堡-兰登进行。

1.3 反硝化过程基理

自然界中的氮循环过程可以使以氨氮形式存在的氮变为氮气排放到大气中，完成氮的脱除，是如今从水环境脱除氮盐的主要方法之一。硝酸盐向无害氮的微生物还原是生物反硝化作用或硝酸盐呼吸作用。通常情况下，反硝化过程是反硝化细菌的无氧呼吸过程，以硝酸盐作为电子受体，进而使硝酸盐一步步被还原，一氧化氮、一氧化二氮，最终变为氮气。电子受体从硝酸盐转移到亚硝酸盐，会导致硝酸盐和亚硝酸盐的反硝化生物动力学明显下降^[4]。生物反硝化是缺氧过程，这个过程涉及从硝酸盐到氮气四个步骤（二氧化氮→一氧化氮→一氧化二氮→氮气）^[5]。这个过程中的每个步骤都是由单独的酶系统催化的。已知反硝化的微生物是可选的生物体，但其中大多数不是专性厌氧菌。而硝酸盐在缺氧条件下被这种微生物用作最终的电子受体。在氮循环过程中，反硝化细菌的反硝化反应则是使硝酸盐氮重新回到大气的主要途径。反硝化细菌广泛存在于水体中，特别是在沉积物中。菌落主要为圆形、白色、表面光滑、边缘整齐、显微镜下呈杆状，属于革兰氏阳性菌。作为氮循环中非常重要的环节之一，它可以通过释放被固定的氮元素并减少温室气体促进氮循环，也是生物法脱氮的重要手段。反硝化作用不是属于某一特定细菌团体，迄今为止实际已知的反硝化细菌仅限于报道的不到100个属，绝大多属于变形菌门最公认的反硝化微生物包括：无色杆菌，产碱杆菌，嗜盐杆菌，甲烷单胞菌，莫拉氏菌，副球菌，芽孢杆菌，棒杆菌，丙酸杆菌，假单胞菌，螺菌，棒状杆菌，硫杆菌和黄单胞菌。

1.4反硝化、反硝化耐盐研究进展

近年来，反硝化的研究也在一步一步往前发展，微生物在各种生态系统的氮循环中起着重要的作用^[6]基于DNA指纹图谱的分析揭示了反硝化反应反应器中微生物多样性的高水平^[7]。传统的微生物脱氮，基本分为两个部分，第一部分是在氧气充足环境下由硝化细菌把氨氮氧化为硝酸盐;第二部分，是在氧气缺乏条件下，即厌氧环境中由反硝化细菌将硝酸盐一步步还原为氮气。但是由于这两种菌的生长环境要求不一样^[8],一个系统不能使两菌同时反应，因此只能将这两种菌分开来。在研究的进展过程中，研究者们在传统原理技术基础上进一步开发，研究出很多同样有脱氮能力的方法,他们将硝化、反硝化过程严格分开，形成了后置的反硝化和前置的反硝化两个部分，在工程应用中主要有A/O、A²/O、Bardenpho、PASF、Dephanox等^[9-13] 。厌氧氨氧化(an aerobic ammonia oxidation，knamlnox) 工艺是近年来成功研发的新型生物脱氮技术的典型代表。^[14,15]。2002年的荷兰鹿特丹，见证世界上第一个生产性的Anammox反应器成功建成，通过这个方法处理污泥压滤液，其容积氮去除率高达9.5kg/(m³·d)。目前，Anammox工艺也正在向世界上其它国家发展^[16]。但是，由于Anammox 反应菌为自养型微生物,倍增培养时间长达两个星期左右,细胞产率也低，而且对环境条件要求严格，十分敏感^[17]，因此导致Anammox工艺启动过程比较缓慢、整个过程也容易失去稳定、失去稳定后更难以恢复，可知此工艺的进程也不会太快，所以其他反硝化菌的筛选也很重要。在反硝化菌的种属方面，Verbaendert等人通过隔离运动和筛选参考菌株组的实验结果，杆菌可能是潜在的促进陆地和其他生态系统反硝化作用的因素，反硝化作用是芽孢杆菌属的一个共同特征^[18]。Caton TM等人在俄克拉荷马州切罗基附近的盐平原国家野生动物保护区的研究发现耐盐菌包括芽孢杆菌属^[19]。说明，耐盐性反硝化芽孢杆菌存在的可能性，说明这个方向有值得研究的潜力，而影响硝化过程的条件很多，如环境、游离的氨、亚硝酸盐浓度、温度、PH等所以要使其尽量在最适条件^[20]。活性污泥里反硝化菌的生物多样性丰富^{【21，22】}，是潜在的挑选样品。

1.5 研究目的和意义

当前对反硝化菌的脱氮性能的研究一般是针对城市生活污水，其盐度很低。但化工、石油等很多工业行业生产过程中产生的废水盐度较高，其脱氮需要在高盐条件下进行，但如今对于高盐条件下反硝化细菌的筛选方法及其反硝化能力的测定研究较为缺乏。所以我们的目的就是在具有反硝化能力的菌中筛选出具有耐盐性的那种，使其在高盐度浓度下，依然可以在其中存活下来并且可以进行反硝化作用，将高盐条件下的废水进行脱氮处理，减少氮素污染，减少水域的富营养化，进而防止水域污染。而且生物反硝化的成本相对于物理、化学方法来说，更加绿色环保，成本更加低廉，持续性也更久一点。种种优点参考下来，所以我们打算对耐盐性反硝化芽孢杆菌的筛选分离及其性能测定进行研究。

1. 实验部分

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1 实验试剂

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