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摘 要

转氨酶是能对化氨基酸及酮酸之间氨基产生催化作用，从而使使来自氨基酸或酮酸中的氨基在适当的ph及温度条件下与氨基受体接触并且将氨基转移至氨基受体上的一类酶，其多存在于动物、植物组织和各种微生物中，尤其在动物的心、脑、肝及肾及绿豆芽中的含量较高。而ω-转氨酶属于转氨酶类，指在转氨酶催化的转氨反应中，其底物或产物中不含有α-氨基酸即可称之为ω-转氨酶。手性胺和非天然的氨基酸在现今市场销售的药物中具备很优良的前景，当下接近四成的药物都是具有氨基的药物，如α-四氢萘胺（抗抑郁药舍曲林的关键结构），西他列汀（糖尿病治疗药物）等。对ω-转氨酶生物催化方法对其底物进行氨化，是避免传统的化学方法的高压高温高能耗生产手性胺的一种有效的方法。此课题将利用底物谱对ω-转氨酶进行表征，得出不同氨基底物和氨基受体对于ω-转氨酶的催化能力。

关键词：ω-转氨酶 底物谱 生物催化

study on the substrates of - transaminase

Abstract

Transaminase is a kind of enzyme that can catalyze the amino between amino acid and ketoacid, so as to transfer the amino to another position. It is mostly found in animals, plant tissues and various microorganisms, especially in the heart, brain, liver, kidney and mung bean sprouts of animals. However, - transaminase belongs to the transaminases, which can be called -transaminases in the substrates or products without -amino acids in the transaminases catalyzed by the transaminases. Chiral amines and non-natural amino acids are promising candidates for the current market, where nearly 40 percent of drugs are amino based, such as alpha-tetrahydronaphthamine (a key structure of the antidepressant sertraline) and sitagliptin (a diabetes drug). It is an effective method to ammoniate the substrates of -transaminase by biocatalysis, which avoids the high pressure, high temperature and high energy consumption of traditional chemical methods to produce chiral amines. In this study, the catalytic capacity of different amino substrates and amino receptors for omega-aminotransferase was characterized by substrate spectrum.

Key words: - transaminase substrate spectrum biocatalysis

目录

摘要 1

Abstract 2

目录 3

第一章 文献综述 5

1.1.概述 5

1.1.1.ω-转氨酶的相关信息 5

1.1.2. 背景介绍 5

1.2.转氨酶合成手性胺的方法 6

1.2.1.不对称合成 6

1.2.2动力学拆分 6

1.3.实验方法 7

1.3.1.比色法 7

1.3.2.HPLC法 7

1.4.总结 7

第二章 实验材料与方法 8

2.1.实验材料 8

2.1.1.实验仪器 8

2.1.2实验试剂 8

2.2.检测方法 11

2.2.1.苯乙酮的检测方法（HPLC） 11

2.2.2.丙酮酸的检测方法(HPLC) 11

第三章 实验步骤与数据 12

3.1.菌体培养 12

3.2.粗酶液的制备 12

3.3.蛋白浓度测定 13

3.4.酶活测定方法 13

3.5.快速检测方法 13

3.6.底物谱测定方法 14

第四章 实验结果与讨论 15

4.1.氨基供体的结果与分析 15

4.1.1.含芳香基团的氨基供体的特异性 15

4.1.2. 不含芳香基团的氨基供体的特异性 15

4.1.3.氨基酸作为氨基供体的特异性 16

4.2. 氨基受体的结果与分析 17

4.2.1.酮酸与酮类氨基受体的特异性 17

4.2.3.醛类及其他类氨基受体的特异性 18

4.3.结果讨论 19

第五章 总结和展望 20

参考文献 21

致谢 23

第一章 文献综述

1.1.概述

手性胺和非天然的氨基酸在现今市场销售的药物中具备很优良的前景，当下接近四成的药物都是具有氨基的药物，如α-四氢萘胺（抗抑郁药舍曲林的关键结构），西他列汀（糖尿病治疗药物）等。对ω-转氨酶生物催化方法对其底物进行氨化，是避免传统的化学方法的高压高温高能耗生产手性胺的一种有效的方法。此课题将利用底物谱对ω-转氨酶进行表征，得出不同氨基底物和氨基受体对于ω-转氨酶的催化能力。

1.1.1.ω-转氨酶的相关信息

转氨酶是能使来自氨基酸或酮酸中的氨基在适当的ph及温度条件下与氨基受体接触并且将氨基转移至氨基受体上的一类酶，其多存在于动物、植物组织和各种微生物中，尤其在动物的心肌、脑、肝及肾及绿豆芽中的含量较高。[1、2、3、4]而ω-转氨酶属于转氨酶类，当在有转氨酶催化的转氨反应中，其氨基供体、氨基受体以及产物中不含有α-氨基酸即可称之为ω-转氨酶[5]，而且其种类较多，分类较广如β－丙氨酸丙酮酸转氨酶、乙酰鸟氨基转氨酶、4-氨基丁酸丙酮酸转氨酶等。[6]

1.1.2. 背景介绍

转氨酶（TAm）是高效合成对映体手性胺的通用生物催化剂。根据氨基酸序列排列，共有六组转氨酶，称为第I类至第VI类，其中第III类TAms的特异性更广（包括可接受结构上不同的醛类和前手性酮类的o-TAms）。由于在合成(R)和(S)胺方面的广泛应用以及可实现的高水平的立体选择性，TAms持续引起人们的广泛关注。此外，它们越来越多地被用于制备具有生物活性和药用价值的化合物。[7]随之而来的是问题，为了建立高效的转氨酶生物工艺来解决存在底物和产物抑制等问题，必须克服反应平衡和对底物增溶有机溶剂的耐受性。蛋白质工程给出了一种强有力的策略来解决这些问题，例如在生产Januvias (sitagliptin磷酸盐)中使7用TAm。[7.a]

在最近的几年中，生物催化的广泛应用是众多制药公司获得了巨大的收益，因为传统的化学制药方法有许多的缺点如严苛的反应条件、需求有毒的过渡金属催化剂及挥发性有机化合物、在单一的催化反应中得不到足够的立体选择性等。而对于酶来说，其在水溶剂中可溶解的能力、在室温下可操作及在ph7时可用使之成为金属催化反应的绿色代替物。[8]

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