摘 要

流行性感冒又称流感，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，其中甲型流感病毒的高发病率和致死率一直以来都是人们关注的焦点。由于甲型流感病毒越来越严重的耐药性，大大降低了M2质子通道药物（金刚烷胺和金刚烷乙胺）的临床治疗效果。在本课题前期苯磺酰胺类抗H5N1抑制剂的研究基础上，我们期望引入对金刚烷胺耐药流感病毒株具有抑制活性的金刚烷醇片段，开发一系列对野生型和耐药型甲型流感病毒均有抑制活性的小分子H5N1抑制剂。

通过分子对接模拟实验，我们发现设计的基于金刚烷醇片段的苯磺酰胺类衍生物与M2质子通道蛋白具有很好的结合效果，结合能为-9.63 kcal mol^-1。在不断探索与尝试后，我们已经合成了该系列化合物的关键中间体，并对其进行了表征。该中间体为后续M2质子通道抑制剂的制备和生物活性测试奠定了基础。

关键词: 流感；H5N1；耐药流感病毒株；苯磺酰胺；分子对接模拟实验

Abstract

Influenza (Flu) is an acute respiratory disease, which is mainly caused by influenza virus. Because of higher mortality and morbidity，influenza A virus has always been the focus. Moreover, more and more serious drug-resistance dramatically decreased the treatment efficiency of M2 proton channel inhibitors (amantadine and rimantadine) in clinic. On the basis of our previous study of benzenesulfonamide derivatives as novel potent H5N1 inhibitors, we designed a series of adamantanol based benzenesulfonamide derivatives as more potent small molecule inhibitors against WT type and mutant H5N1 viruses.

We found adamantanol based benzenesulfonamide derivatives showed excellent binding energy (-9.63 kcal mol^-1) with M2 proton channel protein by molecular docking studies. After continuous exploration and experimentation, we have synthesized and characterized the key intermediates of this series of compounds, which lays the foundation for the subsequent preparation and biological evaluation of target compounds.

Keywords: Influenza; H5N1; Drug-resistant Flu viral strains; Benzenesulfonamide; Molecular docking

目录

摘 要 I

目录 III

第1章 绪论 1

1.1 流感及流感的影响 1

1.1.1 流感 1

1.1.2 流感的影响 1

1.2 流感病毒 2

1.2.1 流感病毒的分类 2

1.2.2 流感病毒的结构 3

1.2.3 流感病毒的复制 4

1.3 抗流感药物及研究现状 5

1.3.1 抗流感药物 5

1.3.2 研究现状 7

1.4 研究目的及立题依据 9

1.4.1 研究目的 9

1.4.2 立题依据 9

1.5 本研究拟定的合成路线 11

1.6 本研究拟定的实验技术方案 11

第2章 4-氰基-N-(2-氰基乙基)-N-(3-(羟甲基)异恶唑-5-基)甲基)苯磺酰胺的合成与表征 13

2.1 前言 13

2.2 实验结果 14

2.2.1 中间体13 (5-(羟甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成 14

2.2.2 中间体14 (5-(溴甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成 14

2.2.3 中间体16 (5-(((2-氰基乙基)氨基)甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成 14

2.2.4 中间体18 (5-(((4-氰基-N-(2-氰基乙基)苯基)磺酰氨基)甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成 15

2.2.5 中间体19 (4-氰基-N-(2-氰基乙基)-N-((3-(羟甲基)异恶唑-5-基)甲基)苯磺酰胺)的合成 15

2.3 实验部分 16

2.3.1 仪器与试剂 16

2.3.2 中间体13 (5-(羟甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成过程 17

2.3.3 中间体14 (5-(溴甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成过程 17

2.3.4 中间体16 (5-(((2-氰基乙基)氨基)甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成过程 17

2.3.5 中间体18 (5-(((4-氰基-N-(2-氰基乙基)苯基)磺酰氨基)甲基)异恶唑-3-羧酸乙酯)的合成过程 18

2.3.6 中间体19 (4-氰基-N-(2-氰基乙基)-N-((3-(羟甲基)异恶唑-5-基)甲基)苯磺酰胺)的合成过程 18

2.3.7 相应化合物的表征数据 18

2.4 本章小结 19

第3章 全文总结与展望 21

参考文献 22

附 录 25

致 谢 28

第1章 绪论

1.1 流感及流感的影响

1.1.1 流感

流行性感冒简称为流感（influenza），是日常生活中一种常见的流行病，主要是由甲型、乙型和丙型三种类型流感病毒（influenza virus）引起的一种急性呼吸道感染疾病，通常爆发在冬季和春季^[1]。空气中的飞沫、人与感染者或被污染物品之间的接触是流感进行传播的两大途径。与普通感冒（common cold）不同，后者主要是由于细菌或鼻病毒（例如rhinovirus等）轻度感染上呼吸道所导致，临床症状较轻，患者一般5-7天便可痊愈，而由于流感病毒潜伏期短，感染者起病急，易出现急起高热、浑身疼痛、显著乏力等临床症状，并伴有呼吸道症状，例如咳嗽、流鼻涕和喉咙痛等，严重时可导致死亡^[1]。不仅如此，流感还有可能会引发肺炎(pneumonia)、心脏损害和神经系统损伤等并发症。此外，由于患者感染流感病毒后的临床症状与其他呼吸道病毒引起的症状有相似之处，所以临床上对流感的诊断存在一定的困难。

流感的分类方面，自16世纪至今，世界范围内的流感可划分为两种形式：即由甲型和乙型流感病毒引起的流行性（季节性或大流行性）流感以及散发性流行病甲型流感病毒引起的流感^[2]。通常情况下，大流行性流感可以通过两种机制发生: 第一，通过(有可能是突变病毒)动物例如鸟类直接传播给人类，正如1918年西班牙流感(H1N1)中所发生的情况; 第二, 通过重组的禽流感病毒(Avian influenza virus)与人类流感病毒, 如发生在1957年亚洲流感(H2N2), 又如1968年的香港流感(H3N2)^[3](图1.1)。

1.1.2 流感的影响

由于流感病毒是一类具有独特抗原变异性、季节性的病毒，其对人类健康及全球经济具有潜在的威胁。其中与乙型和丙型流感病毒相比，由于突变(mutation)和抗原漂移(antigenic drift)，甲型流感病毒具有更高的感染率和致死率^[1]，对人类健康构成重大威胁。从20世纪初至今，人类历史上已爆发过5次危害巨大的甲型流感疫情，其分别为1918年的西班牙大流感（H1N1）、1957年的亚洲流感（H2N2）、1968年的香港流感（H3N2）以及2005年的禽流感（H5N1）等。其中1918年西班牙大流感（H1N1）导致全世界范围内超过5000万人死亡，对人类健康构成了巨大的威胁^[3]。

虽然世界各国早已意识到流感疫情对人体健康及社会经济所带来的严峻挑战，也均积极采取各种措施进行预防，但从近些年流感爆发的状况来看，因流感引起的入院人数和死

图1.1流行型流感的两种发生机制

亡人数均有所增加^[4]，例如虽然临床上有流感疫苗(vaccine)和抗流感药物，但每年的流感疫情期间，仍然导致美国约有36000人死亡和数百万人住院^[5]。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）统计结果显示，每年约有500万重症流感病人，死亡人数约为50万^[5]。同时，世界卫生组织（WHO）的另一项调查数据显示，自2003年以来，共出现了860例人感染H5N1流感病毒的案例，其中454例患者死亡，死亡率高达60%左右^[6]。此外，大流行性流感爆发还对全球经济造成巨大损失^[7]。流感对人类健康和社会发展潜在的威胁远远未根除。

1.2 流感病毒

作为一种呼吸道病原体，流感病毒的潜伏期(incubation)较短，一般为1-7天^[8]。值得注意的是，在非常年轻但患有慢性病的个体、所有年龄段免疫功能低下的个体、孕妇和虚弱的老年人等这类群体当中，流感病毒造成的发病率和死亡率较其他人群高^[9]。

1.2.1 流感病毒的分类

从类别上看，流感病毒属于正粘病毒科家族的负链RNA 病毒，根据流感病毒核蛋白（Nucleoprotein，NP）和基质蛋白（Matrix protein 1，M1）的不同，可将流感病毒分为三种类型：甲型流感病毒 （Influenza A virus，Flu A）、乙型流感病毒（Influenza B virus，Flu B）和丙型流感病毒（Influenza C virus，Flu C）。截止目前，研究人员已从禽类中分离出16种血细胞凝素（H1至H16）和9种神经氨酸酶苷酶（N1至N9），并在蝙蝠体内鉴定出了另外两种血细胞凝集素（H17和H18）和神经氨酸苷酶（N10和N11）。依据甲型流感病毒结构中血细胞凝集素（HA）和神经氨酸苷酶（NA）两种糖蛋白的抗原特异性不同又可将该病毒分为多种亚型, 如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N9等^[1]。

其中，由于突变和抗原漂移，甲型流感病毒可引起所有年龄段的发热性呼吸道疾病的爆发性爆发，这是该型病毒能够导致流感大流行的重要因素，同时也是其感染(infection rate)和致死率(fatality rate)高的根本原因。不仅如此，甲型流感病毒的宿主范围十分广泛，甚至能够跨越物种屏障。与甲型流感病毒不同，乙型和丙型流感病毒感染者的临床症状相对较温和^[10]，虽然乙型流感病毒与甲型流感病毒一样会导致流感疫情的出现，但由于其宿主范围十分有限，而且其感染对象绝大部分为人，只有少数报道中的宿主为海豹、马、狗和猪^[11][12]。丙型流感病毒广泛分布于世界各地，但由于其具有相对较低的患病率和较轻的临床症状，因此该型病毒还未被纳入常规病毒学筛查。

1.2.2 流感病毒的结构

如图1.2 A所示，从结构上看，甲型流感病毒是一种直径约为80-120 nm的球状包膜病毒^[13]，该脂质包膜源自宿主细胞，脂质膜上含有血细胞凝集素（HA）、神经氨酸苷酶（NA）两种糖蛋白(glycoprotein)和M2质子通道蛋白，其中前两者的含量最为丰富，后者含量相对较少。^[14]功能上：血细胞凝集素（HA）负责与含有唾液酸（sialic acid）的受体进行结合，使病毒颗粒得以吸附于宿主细胞表面；神经氨酸苷酶(NA)则能协助病毒颗粒从宿主细胞表面释放。 脂质膜的下方则为蛋白质层，由M1蛋白组成。M1蛋白在流感病毒进行组装和出芽过程中具有重要的作用。附着于M1蛋白质层上含量较少的另一种蛋白质为核输出蛋白（NEP），该蛋白质参与病毒核糖

A） B）

图1.2 甲型流感病毒的结构示意图

核蛋白（vRNP）的核输出过程。而在病毒复制过程中，核糖核蛋白（vRNP）与三个聚合酶亚基PB2组成的病毒RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）有着紧密的联系。图A中丝状结构则为甲型流感病毒的核心，如图1.2 B所示，该核心部分由被病毒核蛋白（NP）包裹的8个vRNA片段组成，这8个vRNA分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NR、M和NS，每个vRNA片段末端的黑色部分表示3'和5'非编码区（NCR）。中间灰色阴影部分表示存在于每个vRNA的3'和5'末端的包装信号，其负责病毒粒子薄膜的形成。颜色最浅部分的数字则代表每种NCR和包装信号的核苷酸长度^[15]。

1.2.3 流感病毒的复制

甲型流感病毒的复制过程，如图1.3所示，首先，流感病毒包膜上的血细胞凝集素（HA）与宿主细胞膜糖蛋白或脂质蛋白上含有唾液酸的受体结合，使得病毒颗粒吸附于宿主细胞膜并通过胞吞作用进入细胞内^[16]，接着在细胞内酸性环境条件下，病毒的M2质子通道蛋白开放，质子得以进入病毒内核，在质子作用下病毒核糖核蛋白（RNPs）游离出来，病毒发生脱壳^[17]，然后M1蛋白质与病毒核糖核蛋白（RNPs）发生解离，使得后者得以进入宿主细胞核进入宿主细胞核内并在RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的作用下进行复制、转录，新的病毒RNA和蛋白质在病毒M1蛋白的协助下进行组装、出芽^[18]，最后病毒颗粒在神经氨酸苷酶（NA）的协助下通过胞吐作用与宿主细胞分离。

图1.3 甲型流感病毒的复制周期示意图

1.3 抗流感药物及研究现状

1.3.1 抗流感药物

针对上述流感病毒复制过程，目前抗流感病毒药物的作用靶点主要有血细胞凝集素（HA）、M2质子通道蛋白、RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）以及神经氨酸苷酶（NA）。而M2质子通道蛋白能够作为抗流感病毒药物作用靶点之一的原因在于，M2质子通道蛋白作为一种pH调节的质子选择性通道，在流感病毒的增殖过程中起到了两个关键作用。首先，流感病毒内部通过对该通道蛋白酸化能促进流感病毒核糖核蛋白释放到感染的细胞中。其次，M2质子通道蛋白能调节宿主细胞的高尔基体腔的pH值，防止其它病毒蛋白的过早的构象变化，以确保这些蛋白质能够被装配到新的病毒颗粒中^[12]。

如图1.4所示，目前应用于临床的抗流感病毒药物只有三类，分别为M2质子通道抑制剂：金刚烷胺（amantadine）和金刚烷乙胺（rimantadine）；神经氨酸酶（NA）抑制剂: 奥司他韦(oseltamivir)(给药途径：口服)、扎那米韦(zanamivir)（给药途径：吸入）、帕拉米韦(peramivir)（给药途径：静脉或肌内注射）和拉尼那米韦(laninamivir)（给药途径：吸入）^[6]；RNA依赖性RNA聚合酶抑制剂法匹拉韦（favipiravir）和索夫鲁扎（xofluza）^[19]。上述除了拉尼那米韦、法匹拉韦由日本批准上市外，其余药物均为美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准上市。

除了上述已应用于临床的抗流感药物外，如图1.5所示，还有部分在研且已经进入临床研究阶段的抗流感药物，例如pimodivir（研发公司：Vertex Pharmaceuticals）、S-033188（研发公司：Shionogi amp; Co.）、AL-794（研发公司：Alios Biopharma Inc）、MEDI8852 (研发公司：MedImmune)、MHAA4549A (研发公司：Genentech)、VIS-410 (研发公司：Visterra)、CT-P27 (研发公司：Celltrion)、CR6261和CR8020(研发公司：Crucell)、TCN032（研发公司：Theraclone Sciences）、Fludase(研发公司：Ansun Biopharma)^[20]。

临床药物中第一个被证实可以有效抑制甲型流感病毒复制的化合物是金刚烷胺（amantadine），其能够阻止质子通过流感病毒的M2质子通道白迁移到病毒粒子内的核内体中^[21]，从而抑制病毒颗粒脱壳释放RNA片段，发挥抗流感作用。金刚烷乙胺（rimantadine）的抗流感作用与金刚烷胺类似^[22]。而奥司他韦(oseltamivir)则是一种神经氨酸苷酶（NA）的可逆竞争性抑制剂，可通过选择性抑制神经氨酸苷酶（NA）来阻断病毒的释放达到抗甲型或乙型流感的目的^[23]。其除了能够用于流感的治疗外，其还能够起到预防作用，能有效保护与流感患者接触的个体不被流感病毒感染。

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