文 献 综 述

1．引言

红豆杉是我国一级珍稀保护树种。红豆杉属浅根植物，其主根不明显、侧根发达，产于甘肃南部、陕西南部、四川、云南东北部及东南部、贵州西部及东南部、湖北西部、湖南东北部、广西北部和安徽南部（黄山），常生于海拔1000-1200米以上的高山上部。研究表明，紫杉醇能抑制细胞分裂，阻碍癌细胞的复制。紫杉醇独特的抗癌机制，使它成了全球抗癌药物研究热点[1-2]。

2.红豆杉及其内生真菌的的相关介绍

红豆杉，又名紫杉，是一种红豆杉属的植物,也是世界上公认的濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物。由于在自然条件下红豆杉生长速度缓慢，再生能力差，所以很长时间以来，世界范围内还没有形成大规摸的红豆杉原料林基地。1994年红豆杉被我国定为一级珍稀濒危保护植物，同时被全世界42个有红豆杉的国家称为”国宝”，联合国也明令禁止采伐，是名符其实的”植物大熊猫”。 红豆杉的药用价值主要体它的提取物#8212;#8212;次生代谢衍生物#8212;#8212;紫杉醇。紫杉醇最早是从短叶红豆杉的树皮中分离出来的抗肿瘤活性成份，是治疗转移性卵巢癌和乳腺癌的最好药物之一，同时对肺癌、食道癌也有显著疗效，对肾炎及细小病毒炎症有明显的抑制作用。红豆杉的根、茎、叶都可以入药，可以治疗尿不畅、消除肿痛，对于糖尿病、女性月经不调、血量增加都有治疗作用。红豆杉也可以用于产后调理，对女性病症具有一定的治疗作用[3]。 内生真菌栖居于生活植物的组织内部，菌体的存在不会对植物造成明显伤害[4] 。人们发现内生真菌已经有100 余年的时间，但是直到美国科学家Stierle 等［5］确证红豆杉树的内生真菌可以产生抗癌药物紫杉醇之后，有关植物内生真菌资源的研究才受到国内外学者更加广泛的关注。 基于地衣、苔藓、蕨类、禾草、藤本、灌木、乔木[6]等各类植物内生真菌的研究结果，内生于健康植物组织中的真菌具有极其丰富的物种多样性［7］ 。这类特殊的真菌资源不仅可以产生重要的生物活性物质［8 － 10］，而且可以促进宿主生长［11 － 13］，增强抗虫能力［14 － 15］，在自然界的物质循环过程中承担重要角色［16 － 17］，植物内生真菌的多样性、资源学、系统学和生态学等已经成为目前真菌学研究领域的热点之一。

3.国内外红豆衫内生真菌的研究现状

紫杉醇(Taxol)最开始是Wani等[18]从短叶红豆杉(T. brevifolia)的树皮中分离得到的，后经Schiff等[19]研究证实紫杉醇具有独特的抗癌作用机理, 它能使癌细胞内纺锤丝的形成受到抑制, 有丝分裂不能正常进行，而阻止了癌细胞的扩散。以后人们开始大量地从红豆杉的树皮中提取紫杉醇以满足需求。由于红豆杉系珍稀植物, 而树皮中的紫杉醇含量很低, 靠树皮提取紫杉醇不能满足需求, 并且严重地破坏自然资源, 危及生态平衡。为了解决药源紧缺状况,目前研究生产紫杉醇的方法主要有四种: ①从天然植物中提取；②半化学合成法[20]；③植物细胞培养法[21]；④红豆杉栽培法。 Stierle与Strobel等[22]首次报道了从太平洋紫杉树中分离出一种可产紫杉醇的内生真菌(Taxomyces andreanae) , 其紫杉醇含量为24-50 ng/ L , 为人们展示了一个可能生产紫杉醇的诱人的新途径。从此国际国内都兴起了内生真菌产紫杉醇研究的高潮，而且紫杉醇产生菌种十分多样，例如Strobel等[23]从西藏红豆杉枝条上分离到一株小孢拟盘多毛孢( P. microspora)，周东坡等[24]从东北红豆杉的树皮中分离筛选出一株树状多节孢( Nodulisporium sylviforme)。利用微生物发酵生产紫杉醇具有许多优点：内生真菌生长迅速, 易于培养；所用的培养基成本相对较低；可以通过优化发酵条件、利用生物技术改良菌种, 大幅度提高产量, 满足市场的需求, 降低紫杉醇的价格同时也能减小对自然界的破坏。所以筛选产紫杉醇内生真菌,用微生物发酵的方法生产紫杉醇, 是解决药源问题的有效途径。利用微生物发酵生产紫杉醇具有许多优点：内生真菌生长迅速, 易于培养；所用的培养基成本相对较低；可以通过优化发酵条件、利用生物技术改良菌种, 大幅度提高产量, 满足市场的需求, 降低紫杉醇的价格同时也能减小对自然界的破坏。所以筛选产紫杉醇内生真菌,用微生物发酵的方法生产紫杉醇, 是解决药源问题的有效途径。本实验室南方红豆杉为原材料，分离内生真菌，经过ITS鉴定和HPLC检测，确定了一株产紫杉醇的内生真菌，属于拟茎点霉属（Phomopsis），虽然内生真菌能产生紫杉醇，但含量均在每升微克级，与工业化生产的要求还有很大距离。目前提高其产量的主要技术手段有：（1）优化培养条件；（2）添加紫杉醇合成代谢途径的前体物，如醋酸盐、苯基丙氨酸，红豆杉针叶提取物等；（3）一些植物生长调节剂对内生真菌产紫杉醇有一定的调节作用，如：氯化胆碱对内生真菌产紫杉醇有抑制作用;而N－二甲氨基琥珀对其有提高产量的作用[26]；（4）传统的诱变育种，徐峰等[27]通过诱变育种结合培养基的优化，使Fusarium mairei产紫杉醇产量从20 μg/L提高到220 μg/L；（5）通过基因构建工程菌株，通过研究产生内生真菌合成紫杉醇的基因组,紫杉醇的代谢途径以及相关酶类，对其进行遗传改造,构建紫杉醇高产的工程菌株,提高紫杉醇的产量。

4.内生真菌的分离与鉴定

4.1 内生真菌的分离

参考平板灌注法[28],将采集的新鲜样品用流水冲洗10min，然后放入75% 的乙醇中浸泡30s，取出后用无菌水漂洗3 次，再放入0.1% 的升汞溶液中浸泡5-7 min，取出后用无菌水漂洗5次。叶片用无菌剪刀剪去边缘后剪成约0.5cm#215;0.5 cm 的方块；枝条用无菌手术刀削去四周，取中间部位剪成1 cm 长的小段；树皮用手术刀去掉外皮层后，剪成0.5 cm#215;0.5 cm 小块。用最后一次漂洗用的无菌水涂板作为阴性对照。处理好的样品放入事先准备好的PDA 平板培养基中，28℃恒温培养，待长出菌丝后，挑取平板中单一菌落进一步纯化，纯化后的菌株转接到装有PDA 培养基的斜面上，4℃冰箱保存。