文 献 综 述

1.1苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸的简介

1.1.1苯丙氨酸衍生物的简介

苯丙氨酸系统名：2#8212;氨基苯丙酸，具有生物活性的光学异构体为L-苯丙氨酸。常温下为白色结晶或结晶性粉末固体，溶于水，难溶于甲醇、乙醇、乙醚等溶剂。

其结构式如下：

衍生物：指一种简单化合物的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代而衍生的较复杂的产物。

根据取代位置的不同可以得到不同的苯丙氨酸衍生物。当其所含苯环上的氢被卤素、硝基或甲氧基等其他集团取代后就可以得到卤代苯丙氨酸，硝基苯丙氨酸、甲氧基苯丙氨酸等一系列苯丙氨酸衍生物。取代的苯环上氢的位置的不同也会得到不同的取代产物，可以有邻位、间位、对位三种取代产物。当氨基氮上的氢原子被其他原子或基团取代又可得到其他的苯丙氨酸衍生物，如：N-甲酰基#8212;L#8212;苯丙氨酸。

1.1.2杂环丙氨酸的简介

丙氨酸系统名：2-氨基丙酸（α-丙氨酸），3-氨基丙酸（β-丙氨酸)。白色或类白色结晶性粉末。

分子式:

杂环：杂环是指由碳原子及非碳原子构成的环状结构，环中的非碳原子为杂原子。常见的杂原子有氮、氧、硫等。

杂环丙氨酸可以理解为丙氨酸的衍生物，当丙氨酸的氢原子被杂环取代时，就可以得到一系列的杂环丙氨酸。也可以理解为苯丙氨酸的苯环被杂环所取代。根据取代的杂环的不同可以得到不同的杂环丙氨酸，早在上世纪60、70 年代，人们从野豌豆族的植物中发现并分离出了一系列含有杂环的非蛋白游离氨基酸。这类氨基酸大多为丙氨酸β位杂环取代的衍生物,例如：β-( 异噁唑-5-酮-2-基) -丙氨酸。β-( 异噁唑-5-酮-2-基) -丙氨酸( BIA) 是一种由异噁唑-5-酮环取代丙氨酸β 位的H 原子而形成的一种游离氨基酸^[1]。

1.2苯丙氨酸衍生物与杂环丙氨酸的制备

1.2.1苯丙氨酸衍生物的制备

以最简单的硝基苯丙氨酸为例：

采用釜式反应器，以混酸（浓硫酸和浓硝酸）为硝化试剂对L#8212;苯丙氨酸进行硝化反应，即可得到目标产物^[2]。同样，可以通过卤化、磺化或是F-C反应都可以得到不同的苯环上取代的苯丙氨酸衍生物。而氨基氮上氢被取代的衍生物则需要不同的反应条件。

1.2.2杂环丙氨酸的制备

丙氨酸杂环取代衍生物的生物合成大多与半胱氨酸合成酶的催化有关，其中丙氨酸残基要么来源于丝氨酸，要么来源于O-乙酰丝氨酸，但杂环来源多样。

同样以BIA为例：体外实验表明，BIA 由异噁唑-5-酮和O-乙酰丝氨酸在半胱氨酸合成酶催化下合成。异噁唑-5-酮推测来源于天冬酰胺^[1]。

1.3 苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸的应用

1.3.1苯丙氨酸衍生物的应用

苯丙氨酸衍生物是生产医药产品类抗生素的重要中间体，同时还是合成多肽激素、多种农药的重要中间体，比如促进胰岛素分泌的格列奈类药物中的那格列奈广泛便是苯丙氨酸的衍生物。同时可以作为受体拮抗剂、酶制剂和抗血栓药物的中间体，因此在医药领域应用广泛^[3]。其中L-苯丙氨酸是重要的食品添加剂-甜味剂阿斯巴甜的主原料，人体必需氨基酸之一。邻苯基取代的苯丙氨酸衍生物由于其具有的荧光特性也可以作为荧光探针检测蛋白质的局部环境^[4]。

1.3.2杂环丙氨酸衍生物的应用

杂环丙氨酸由于可以作为合成医药产品中许多抗生素、多肽激素、农药中间体或是作为多种重要活性药物的修饰基团广泛应用于药物学领域。如丙氨酸修饰的三嗪环蕃有特殊的内空腔及外围结构，在分子识别、人工模拟酶、催化剂等方面的应用有广泛前景^[5]，同时杂环丙氨酸与苯丙氨酸类似，在抗肿瘤作用上也有一定效果，比如β-2-噻吩基丙氨酸作为苯丙氨酸的同电异素及抗代谢物，可以表现出抗肿瘤效果，可以作为治疗肿瘤的化学治疗剂^[6]。

1.4国内外苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸现状与前景

由于苯丙氨酸衍生物与杂环丙氨酸用途广泛，因此在医药、农药、食品及精细化工市场前景广阔。国内外对苯丙氨酸衍生物以及杂环丙氨酸的需求量大。其中苯丙氨酸对肿瘤生长的影响，在苯丙氨酸衍生物的抗肿瘤作用上也取得较大进展。

近年来，随着人们生活水平的提高，医药保健类产品生产的不断进步，我国对医药产品类抗生素急需突破性发展，以及对多肽激素和多种农药的需求，都使得我国对苯丙氨酸衍生物与杂环丙氨酸的需求量日益增长。目前国内仅仅是少批量生产苯丙氨酸衍生物与杂环丙氨酸，其产品质量和制造成本都缺乏与国外大公司竞争的能力，因此提高生产产量、产品质量 以及检测精度急需取得重大突破，是苯丙氨酸衍生物与杂环氨基酸产品的研究发展方向。

2.1苯丙氨酸衍生物与杂环氨基酸的检测

苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸含量的测定主要有高氯酸法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、薄层色谱法等。

2.1.1高氯酸滴定法简介以及实验操作^[7]

高氯酸滴定法即利用酸碱中和反应，用高氯酸滴定样品中的苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸，同时存在乙酸，并以结晶紫为指示剂，当溶液滴定至绿色时即为滴定终点。

首先称取适量含苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的待测样品(相当于99%的苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的待测样品0.20ɡ左右），精确至0.0001ɡ，然后滴加3mL甲酸，搅拌至完全溶解，再加冰乙酸30mL,结晶紫指示剂适量，用高氯酸标准溶液滴定试液，直至颜色变绿即为终点，记录消耗高氯酸标准溶液的体积(V₁) ，同时做空白试验，记录消耗高氯酸标准溶液的体积(V₀)。苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸含量计算：

式中：C----滴定试液时高氯酸溶液的浓度,mol/ L；

V₁----试液消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；

V₀----空白消耗高氯酸标准溶液的体积，mL；

m----含取代芳基甘氨酸样品的质量，ɡ；

K----1.00mL高氯酸标准溶液（CHClO₄=0.1000mol/L)相当于含苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸样品的质量,mg。同一样品进行两次测定，取平均值，结果修约到保留一位小数。

高氯酸法是一种化学滴定的方法, 测定含取代芳基甘氨酸样品时，其误差较大,操作繁琐。

2.1.2毛细管电泳法简介及实验操作

毛细管电泳（CE）又称高效毛细管电泳，是近年来发展站起来的一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析方法，在现代分析化学中有广泛应用。毛细管电泳包括电泳、色谱及其交叉的内容。近年来随着科学技术的发展，高效毛细管电泳法（HPCE）技术广泛应用于实验室手性拆分。CE近样少，柱价低，易清洗，方法简便，分析时间短，较符合绿色化学要求，对环境造成污染小^[8]。

HPCE用于手性拆分有高效、简单、低消耗、符合绿色化学等优点, 其较高的分离效率使分离选择系数较小的对映体, 可以得到满意的分离效果；分离模式多且变换简单, 使用不同的手性选择剂或改变电解质溶液的组成, 即可提高或改分离选择性；手性选择剂、缓冲液和样品消耗量少。CE也存在检测灵敏度不足、重现性差的局限性^[9]。HPCE以高压电场为驱动力, 以毛细管为分离通道,依柱中各组分之间的迁移速度和分配行为的差异而实现分离，由于各组分迁移虚度不同，被检测器检测到的时间不同^[8]。苯丙氨酸衍生物与杂环丙氨酸是β-内酰胺类抗生素的重要中间体，检测合成该物质的反应过程中，反应物、中间物和产物及其手性变化，对于提高生产水平有重要指导作用。毛细管电泳法可分离反应过程中产生的几种手性化合物。

操作：取含适量苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的待测样品，进行样品预处理。确定电泳条件：熔融石英毛细管75cm(60cm处检测窗口）#215;50μm；缓冲液：0.2mol/L硼酸盐（PH=8.29）；分离电压 23KV；进样压力3.45KPa；进样时间3.0s；分离温度：25℃；UV-Vis检测器检测波长200nm。每次电泳分析之前依次用0.1mol/L NaOH、0.1mol/L HCl、二次蒸馏水、缓冲液冲洗。配制标准溶液，电泳分析，以峰面积对相应的质量浓度进行线性回归，作标准曲线以确定待测物含量^[10]。

2.1.3薄层色谱法简介及实验操作^[11]

薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）是指将供试品溶液点样于薄层板，经展开，检视后得到的色谱图，同时用合适的标准对照物作对照，按照相同方法所得的色谱图比较，广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂类、生物碱等多种物质的分离和鉴定，可以作为药品的鉴定和杂志的检测的方法^[13]。但在氨基酸分析实验中，常出现显色效果不好及拖尾的现象。

薄层色谱法的工作原理是将固相支持物(也叫吸附剂)均匀铺在玻璃板上使之成为薄层，将待分析的样品点到薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的扩剂中，在密闭的层析缸中展层。由于各种氨基酸的理化性质(分子极性、分子大小和形状、分子亲和力等）不同，其在吸附剂表面的吸附能力各异。当展开剂在薄层板的毛细管中移动时，点在薄板上样品的组分就不同程度地随着展开剂移动，使不同的氨基酸得以分离。

操作：（1）首先是制备对照溶液，供试溶液以及薄层板。根据供试品的不同，选择合适的标准溶液。称取适量含有待检测物质苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的样品配置供试溶液。然后制备薄层板：调浆：称取硅胶14g，加黏合剂25 mL，置于研钵中充分研磨成均匀的膏状；涂布：取两块洁净的干燥玻璃板（20cm#215;20cm）置于涂布器上均匀涂层；干燥：将玻璃板水平放置，室温下自然晾干；活化：晾干的薄层板置于烘箱内，105℃活化30 min，切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。

（2）点样：分别取对照品溶液和供试品溶液适量，一般取10micro;L，在同一硅胶G薄层板上，距底边2cm水平线上均匀确定5个点点样。点样时用毛细管注意轻轻接触薄层表面，每次加样后原点扩散直径不超过3mm，干后（可以利用吹风机迅速吹干）再继续点样保证含有足够样品。

(3)展层。在层析缸中加入展开显色剂1cm厚，加盖平衡0.5 h。将薄层板点样端浸入展开显色剂，展开显色剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层，当其倾斜上行至层析板3/4处，停止展层，取出薄板，用铅笔描出溶剂前沿界线，用热风吹干,即可出现氨基酸显色斑点。

薄层色谱是一种氨基酸分离方法，但无法定量定性准确检测出取代苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸含量。

3 .1HPLC法检测苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸

3.1.1 HPLC简介

高效液相色谱（High performance liquid chormatography,HPLC)亦称高压液相色谱或高速液相色谱，是20世纪60年代开始发展起来的一项重要的分离和鉴定新技术。由于它是在经典的柱层析、薄层层析、和气相色谱的基础上发展起来的，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展，大大提高了经典柱层析和薄层层析的分析速度慢、灵敏度低、分离度差等缺点，并能使气相色谱上不易汽化或高温下易破坏的化合物得到有效的分离和分析。在技术上采用高压泵、高效固定相和高灵敏度的检测器，可以分离、分析除气体以外的绝大部分有机化合物及无机物，目前已知世界上化合物的80%左右都可以通过HPLC法分析，因而广泛应用于化工、有机合成、环境监测、医药卫生、生物化学及中草药化学成分的分离分析等各个领域的研究，居于色谱法应用之首^[12]。

高效液相色谱法有”四高一广”的特点：高压，高速，高效，高灵敏度，应用范围广。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点。因此，高效液相色谱法广泛应用于医药研究、食品分析、环境检测中^[13]。

3.1.2高效液相色谱法原理

高效液相色谱法基本原理是混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的不同，随流动相在色谱柱中运行时，使得原来的分配系数具有卫校区别的各组分在保留能力上产生明显差异，因此在柱中移动速度不同，经过色谱柱后，彼此分离，依据移动速度不同流出顺序不同。

高效液相色谱法的两相中有一相是固定的，叫做固定相，固定相的选择根据相似相溶原理。如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低级性化合物，可以选择非极性或亚极性固定相。相反，溶质溶于极性温和溶剂则选择极性固定相，有时也可以选择非极性固定相。有一相是流动的，叫做流动相。流动相组成、极性改变可显著改变分离状况。根据分离机制的不同可以有液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法等。色谱图是色谱柱流出物通过检测器时所产生的相应信号对时间的曲线，纵坐标为信号强度，横坐标为时间。在HPLC中流动相是液体，所有要分析的样品必须能溶解在流动相中，流动相带着样品与固定相做相对运动。

3.1.3 HPLC法操作步骤

（1）仪器与试剂的选择:主要选择合适的检测器以及确定配置待检测样品的溶剂。

（2）色谱分析条件的确定：确定色谱柱，流动相，柱温以及检测波长。

（3）标准溶液制备：分别精密称取苯丙氨酸衍生物或杂环丙酸等合适的对照品配制标准溶液。

（4）标准曲线的制备：利用已配制好的标准溶液，分别精密吸取等差浓度5组溶液置于容量瓶，定容摇匀，依照色谱条件以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。

（4）供试品溶液的制备：精密称取含有苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸样品适量，配制溶液。

（5）实际样品的测定

（6）数据分析

苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的测定采取高效液相色谱法。采用汉邦ODS-C₁₈柱和可变波长紫外检测器，进样量10μL ，对苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸进行分离和检测，确定一个良好的线性范围、回收率和相对标准偏差（RSD）。该方法简便、快速、准确、灵敏度高、重现性好。

3.1.4分离条件的选择与优化

（1）检测波长的选择

（2）HPLC法控制条件（如流速、时间、温度、配料比等）的优化选择^[14]

（3）流动相的选择(如选择不同类型的流动相以及流动相的PH^[15]

(4)色谱柱的选择^[16]

4 HPLC法检测苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸的意义

苯丙氨酸衍生物和杂环丙氨酸含量的分析方法没有国家标准或行业规范，国内也鲜有报道。我们采用HPLC法检测取代芳基甘氨酸的含量，该方法与其他检测方法相比，操作相对方便，准确度高，为研究过程中工艺条件的优化和过程监控提供了一种非常有效的方法。

(1) 本法定量的依据是苯丙氨酸衍生物或杂环丙氨酸的含量与峰面积有关,优化条件后的HPLC法避免了因吸收峰不能完全分开等影响峰强度测定的因素；(2) 该法操作简单，既避免了化学滴定法等检测方法繁琐的操作步骤,又提高了实验精密度，避免了步骤过多引起的误差增大；(3)分析速度快。一旦线性关系式确定,测定一个样品只需几分钟,因此特别适用于例行分析的场合。

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